同卵雙胞胎膽道閉鎖患兒染色體核型和全外顯子組測序分析

陳 揚，余 晨，熊希倩，賈金富，詹江華

（1.天津市兒童醫院普通外科，天津300134；2.天津醫科大學研究生院，天津300070）

膽道閉鎖（biliary atresia,BA）是新生兒期嚴重的、外科梗阻性黃疸的常見原因之一，病因不清，認為可能與病毒感染、免疫損傷、遺傳易感性以及環境因素等有關。近年，關于BA遺傳學背景的研究有很多，主要通過全基因組多態性分析總結與BA發病相關的位點，包括 ADD3、MIF、GPC1、ICAM-1、IL-8及VCAM1等[1-4]，但目前仍無確鑿的證據證明某一基因改變與BA的發生有直接必然的關系。以雙胞胎為研究對象，探討環境因素和遺傳因素在疾病發病機制中作用的相關報道有很多，包括在Crohn's病、范德沃徳氏綜合征（Van der Woude Syndrome）及多發性硬化等疾病中均有報道。單胎發病的同卵雙胞胎BA患兒，來自同一受精卵、相同的子宮內環境以及相似的生后環境，其患病情況不同。本實驗以3對臨床表型不同的同卵雙胞胎BA患兒為研究對象，分別進行染色體G顯帶核型分析和全外顯子組測序，檢測該對雙胎兒是否存在染色體核型異常和差異基因型，初步探討膽道閉鎖發生的遺傳學背景。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集3對同卵雙胞胎BA患兒臨床資料，均為雙胎之一患膽道閉鎖，診斷依據術中膽道造影及肝活檢結果，采集雙胎兒外周靜脈血作為實驗樣本，分別進行染色體G顯帶核型分析和全外顯子測序分析。本實驗經天津市兒童醫院倫理委員會審查并通過。

1.2 實驗試劑與儀器 主要試劑：人血液樣本DNA提取試劑盒，無酶水、無水乙醇、秋水仙素、75%甲醇、25%乙酸、0.2%胰酶消化液，均購自天根生化科技有限公司。姬姆薩染液，人體外周血淋巴細胞培養基，0.075 mol/L的氯化鉀溶液，均購自北京博奧森生物科技有限公司。主要儀器：NanoDrop2000分光光度儀（美國Thermo公司），恒溫培養箱，恒溫水浴鍋（德國IKA公司），光學顯微鏡（Olympus）。

1.3 實驗步驟

1.3.1 染色體G顯帶染色步驟 （1）取血：用肝素抗凝的采血管分別取雙胞胎外周靜脈血各4 mL；（2）接種、細胞培養：將外周血液標本接種于人體外周血淋巴細胞培養基中，隨后置于CO2、37℃恒溫培養箱內培養72 h；（3）秋水仙素處理、低滲處理：加入10 μg秋水仙素，繼續培養2 h，離心10 min，再與KCl溶液混勻，37 ℃水浴 20 min；（4）預固定、固定：在離心管中加入甲醇和乙酸固定液，靜置10 min，離心，棄上清液，獲得固定液，將固定液置于新的離心管中，37 ℃水浴 10 min，離心，棄上清液；（5）制片、染色：將固定液置于新的離心管中，在載玻片上滴加2滴細胞懸液，烘干，取出玻片后先用胰酶消化，再用Giemsa染液染色；（6）顯微鏡下觀察細胞分裂相，并進行染色體核型分析。

1.3.2 全外顯子組測序實驗步驟 （1）按照DNA提取試劑盒說明書提取血液樣本總DNA；（2）用NanoDrop 2000分光光度儀對所提DNA樣品濃度和純度進行測定；（3）全外顯子組測序，將提取合格的血液樣本DNA送至測序公司進行測序和數據處理。包括①文庫的建立；②IlluminaHiSeq上機測序；③測序數據的處理；④目標基因在KEGG數據庫中的注釋。分析軟件及數據篩選數據庫：（1）原始數據定位軟件-BWA（Burrows-Wheeler Aligner）；（2）數據校準-Genome Analysis Toolkit 1.3-22-glbfe280；（3）SNP calling-SAMtools（Sequence Alignment/Map Tools）；（4）dbSNP數據庫（version 135）；（5）千人基因組（1 000 genome）數據庫（version 1 000 g2012apr）。

2 結果

2.1 臨床資料 Twin1，同卵雙胞胎兒，女性，足月剖宮產，其中之一患膽道閉鎖，另一雙胎兒正常，患兒出生后3 d即出現黃疸，因黃疸持續未退于生后46 d來我院就診，查體患兒皮膚及鞏膜黃染，蒼白便，茶色尿。肝功能結果提示梗阻性黃疸。母親乳汁病毒學檢查CMV-DNA為8×103個/mL，提示患兒可能有CMV病毒感染。腹部超聲示：膽囊窩未見正常膽囊形態，僅見裂隙樣囊性結構，約14 mm×3 mm，壁粗糙，較硬，未見明顯粘膜線回聲。膽總管未探及，第一肝門區可見局限性強回聲區約12 mm×3.5 mm呈條索狀，肝脾增大（圖1）。術前未行肝活檢。患兒生后49 d行開腹探查術，術中膽道造影和冰凍肝活檢結果符合肝外膽道梗阻，行Kasai手術，術后3個月患兒黃疸完全消退，大小便恢復正常顏色，術后恢復良好。隨訪期間患兒共發生2次晚期膽管炎，入院治療1周后好轉出院。隨訪3年患兒未發生其他嚴重的并發癥。

圖1 彩色Doppler超聲檢查結果Fig 1 The results of Color Doppler ultrasound

其余兩對雙胎皆為男性，同卵雙胞胎，其中之一患膽道閉鎖，另一雙胎兒正常，兩患兒分別于生后168 d和63 d行Kasai手術，術中膽道造影和肝活檢結果符合肝外膽道梗阻診斷標準，于患兒術后2個月和3個月黃疸消退，隨訪期間未出現其他嚴重并發癥，預后良好。

2.2 雙胞胎染色體核型檢查結果 本組3對同卵雙胞胎BA患兒外周血染色體常規G顯帶核型分析結果顯示，核型分別為 46，XX 或 46，XY（圖 2），該組雙胎兒的染色體核型均未見異常，未見伴發染色體數目或結構異常。

圖2 雙胞胎染色體核型檢測結果Fig 2 The results of twins karyotype test

2.3 雙胞胎外顯子測序結果

2.3.1 測序數據及覆蓋度 本組同卵雙胞胎的全外顯子組測序質量較好，平均測序深度100×。將測序數據與相應數據庫進行比對，并通過Annovar軟

件對檢測到的突變位點進行功能注釋。BA同卵雙胞胎測序結果顯示共檢測出10個差異SNP位點，但通過測序驗證分析以上10個差異位點在雙胎兒中序列均一致，說明差異SNP位點是由檢測錯誤造成的，本組單胎發病的BA同卵雙胞胎不存在SNP差異型。另外雙胎兒插入/缺失（InDel）和基因拷貝數（CNV）在雙胎兒中均未檢測到差異位點。

2.3.2 膽道閉鎖同卵雙胎兒的部分SNP位點 分析總結以往文獻報道過的與膽道閉鎖發生相關的部分SNP位點（表1）。

表1 雙胞胎BA患兒部分SNP位點Tab 1 Partial SNP loci in patients with twin BA

2.3.3 突變基因在KEGG數據庫中的整體分布情況 將全外顯子測序獲得的所有突變位點比對到KEGG數據庫中，結果顯示大多數變異位點都集中在免疫系統、病毒感染以及信號轉導等方面，說明在膽道閉鎖發生過程中免疫損傷和信號轉導等起重要作用（圖3）。

圖3 突變基因在KEGG數據庫中的分布情況Fig 3 Distribution of mutant genes in the KEGG database

3 討論

3.1 同卵雙胞胎BA患兒臨床特點分析 研究普遍認為，術時年齡小于60 d的BA患兒，會獲得較好的預后[5-6]。kasai術時年齡越早，其肝細胞受損程度、炎癥細胞浸潤以及肝纖維化程度越輕，患兒自體肝生存時間越長。Shinkai等[7]的數據結果顯示，kasai術時年齡≤70 d的患兒與術時年齡＞70 d相比，前組20年自體肝存活率明顯高于后組，分別為50.88%和28.57%。本組BA患兒分別于生后49 d、63 d和168 d行kasai手術，術時肝纖維化程度較輕，術后膽汁引流通暢，黃疸消退較快，自體肝生存至今，預后較好。

成功的kasai術后肝內膽汁引流通暢，黃疸多在6個月內逐漸消退[8]。Wildhaber等[9]通過比較kasai術后黃疸消退組與未消退組患兒自體肝生存情況，結果顯示前組患兒2年、5年自體肝存活率明顯高于后者，分別為60%vs4.8%和60%vs0。本組BA雙胎兒術后黃疸消退較快，3個月內黃疸完全消退，大、小便顏色恢復正常，隨訪至今肝功能指標和肝臟纖維化特異性指標多在正常范圍內波動，患兒狀況良好。

3.2 同卵雙胞胎BA患兒染色體核型分析 人類的染色體是遺傳物質的載體，也是細胞遺傳學的主要研究對象。染色體核型異常包括數目異常和結構異常。同卵雙胞胎雖由同一個受精卵分裂、分化發育而來，但在發育成單獨個體的過程中，可發生染色體的異常而致病。染色體異常的患者可表現為智力低下、生長發育遲緩、特殊體征以及發育異常等臨床特點。

文獻報道2對同卵雙胞胎同患急性淋巴細胞性白血病，但染色體核型不同，其中一對雙胞胎G顯帶染色體核型分別為46，XX和46，XX，t（4；11）（a21；q23）；另一對染色體核型分析結果為46，XY，-4，+10，-13，del(14)(q24)，-15，+2mar/46，XY 和46XY[10]。學者認為宮內單克隆起源假說以及胎盤內轉移機制是同卵雙胎同時患病的主要原因，但不能除外不同克隆起源的可能，而且表觀遺傳學在疾病發展中可能還發揮著一定的作用，影響個體細胞遺傳學和分子生物學特性。Chang等[11]的研究中，一對同卵雙胞胎兒其中之一患21三體綜合征，其染色體核型為47，XY+21；另一雙胎兒為46，XY，染色體核型正常，且未出現任何臨床癥狀，認為同卵雙胞胎出現不一致的染色體核型的原因，可能是前卵裂體開始時，母體21號染色體減數分裂未分離導致的，雙胎之一保持21三體，并且另一個雙胎體在胚胎形成之前即在桑葚胚或早期囊胚期進行三體性拯救，使胎盤呈21三體嵌合體，胎兒為正常染色體組成。

回顧膽道閉鎖雙胎文獻，同卵雙胞胎單胎發病和雙胎都患病的病例均有報道，但單胎發病的情況更多見，通過檢索文獻未發現關于BA患兒染色體核型分析的研究，本實驗通過對同卵雙胞胎外周血進行染色體G帶核型分析，結果顯示雙胎兒核型為46，XX或46，XY，未發現染色體核型異常，初步說明同卵雙胞胎BA患兒出現不同臨床表型可能與染色體異常無關。

3.3 同卵雙胞胎BA患兒全外顯子組測序分析 外顯子組測序是目前用于鑒別遺傳性疾病新發致病基因的重要研究工具。通過檢索文獻發現，本實驗是目前首次以同卵雙胞胎BA患兒為研究對象，進行全外顯子組測序，試圖找到膽道閉鎖遺傳學病因的研究。在3對雙胞胎中共檢測到10個差異SNP位點。差異SNP位點表現為該位點在雙胞胎之一是雜合子，在另一個雙胞兒是純合子，或者該位點在雙胞胎中均為純合子，但是具有不同的核苷酸。這些差異SNP位點通過測序實驗進行驗證，結果發現以上所有的差異SNP堿基序列在雙胞胎中均一致，說明以上10個差異SNP位點是由檢測錯誤造成的，該組同卵雙胞胎兒之間所有SNP位點均一致。同時分析測序結果中的插入、缺失(Indel)以及基因拷貝數變異（CNV）情況,未檢測到以上各類型的差異基因型。本組BA同卵雙胞胎，雖單胎發病，出現不同的臨床表型，但雙胎兒之間不存在任何差異基因型，提示BA發生可能不是單純的遺傳性疾病，可能與外顯率或遺傳表觀修飾如DNA甲基化有關，有待下一步研究證實。

3.4 同卵雙胞胎BA患兒相關SNP位點分析 目前關于膽道閉鎖遺傳學病因的研究有很多，主要通過二代測序技術總結與膽道閉鎖相關的突變位點，但目前為止尚未發現與BA發生直接相關的基因突變。目前認為與BA發生相關性較強的有ADD3、GPC1和VEGFA基因等。

ADD3基因編碼內收蛋白-3，它在消化道、肝組織以及膽管上皮細胞的細胞連接處表達，主要參與細胞骨架的組裝、細胞遷移和收縮。學者Cheng等[12]通過基因芯片技術在339例BA組和401例正常對照組研究發現，在10q24.2的啟動子和增強子區的SNP位點rs17095355可通過調控ADD3基因在肝組織的表達水平影響膽道系統的發育和相應生物學功能。Tsai等[13]對高加索人171例BA患兒和1630例正常兒的ADD3基因進行篩查，研究發現ADD3基因上的rs7099604與膽道閉鎖發生密切相關，且ADD3基因在BA患兒肝組織特異表達。

GPC1基因位于2q37.3上，主要編碼磷脂酰肌醇蛋白聚糖1，可通過糖基-磷脂酰肌醇鍵連接到細胞膜上，在細胞之間發揮信號轉導的作用，主要介導炎癥發生和通過Hedgehog信號通路、Wnt信號通路以及成纖維細胞生長因子調控細胞間信號傳導。學者Leyva-Vega[2]通過對30例BA患兒進行全基因組多態性分析，數據結果顯示有2例BA患兒的2q37.3區域存在正常基因拷貝數片段的異常缺失。Cui等[14]利用全基因組相關性分析方法對位于2q37.3的GPC1進行相關SNP位點和CNV變異分析比較，觀察到在BA患兒組中GPC1基因有明顯的拷貝數缺失，并利用斑馬魚對GPC1基因進行功能驗證，發現在敲除GPC1基因的斑馬魚中，該片段缺失后，斑馬魚幼體在短期內就出現了膽道發育缺陷。

VEGFA基因位于6p12，編碼肝素結合蛋白，作為血管生成調節劑和炎癥反應介質，越來越多的證據表明VEGFA可能在BA的發病機制中發揮作用[15-16]。2010年學者Lee等[17]通過基因芯片技術，探究位于VEGFA基因上的SNP位點rs3025039與臺灣人的患BA的關系，結果證實該SNP位點可使患膽道閉鎖的風險增加。最近的一項研究對1 336名西北漢族中國人進行VEGFA基因分型，包括311名BA患者和1 025名健康對照樣本，結果發現SNP位點rs3025039與BA風險相關性較強，rs3025039的CC基因型比其他兩種基因型的發病率高，表明C等位基因是一個患膽道閉鎖的風險等位基因[18]。

盡管目前關于BA基因學的研究有很多，以雙胎或家族性BA病例為研究背景的研究尚未見報道，可能由于BA本身的發病率較低，而且雙胞胎BA或家族性BA發病病例更為罕見。本組BA雙胎兒雖存在以往文獻報道的部分SNP位點，但雙胎兒之間基因型完全相同，提示單個或幾個核苷酸變異尚不足以致病。

3.5 突變基因在KEGG數據庫中的整體分布情況分析 目前普遍認為BA發生是由遺傳、炎癥、免疫損傷、感染及其他環境條件等諸多因素共同作用的結果。從KEGG通路圖可以看出，免疫損傷、病毒感染以及信號轉導在膽道閉鎖發生過程中起重要作用。

Treg細胞通過產生調節性細胞因子、接觸抑制及競爭作用等發揮免疫抑制作用，在自身免疫性疾病和感染性疾病中扮演著重要的角色，Th17細胞則起促進炎癥反應的作用，可通過自身細胞增殖干擾Treg細胞發揮免疫抑制功能，阻斷Treg細胞的抗炎癥反應能力。以往研究發現，BA患兒外周血中Th17細胞數量明顯增加，而Treg細胞數量顯著減少，隨著疾病進展，Treg/Th17比值呈降低趨勢[19]。另外，Treg細胞和Th17細胞之間平衡的紊亂還見于自身免疫性硬化性膽管炎、原發性膽汁性肝硬化等，說明Treg/Th17細胞比率降低引起的免疫炎癥性紊亂參與了BA發生發展過程。

本實驗以同卵雙胞胎BA患兒為研究對象，試圖通過染色體核型分析和全外顯子方法初步分析膽道閉鎖發生的遺傳學背景，但限于目前實驗所獲取的雙胎兒血液樣本數量較少，難以得出具有統計學意義的結果，有待于繼續收集實驗樣本，進一步深入研究。

綜上，本組中雙胞胎膽道閉鎖患兒均為單胎發病，即雙胎之一患膽道閉鎖，另一雙胎兒出生正常，且隨訪期間未出現與黃疸相關疾病或伴發其他先天畸形。臨床表型不同的同卵雙胞胎BA患兒，其染色體核型無異常，提示膽道閉鎖發生可能與染色體異常無關；雙胎兒全外顯子組測序結果未發現異常基因型，提示膽道閉鎖發生可能不是單純的遺傳性疾病，可能在一定的遺傳學背景下，外在的某些環境因素如病毒感染、毒素、免疫損傷等觸發膽道閉鎖發生。