芪參益氣湯對阿霉素致心力衰竭大鼠心功能及miR133a表達的影響

慢性心力衰竭(CHF)以呼吸困難、疲乏、雙下肢水腫等為主要臨床表現的各種心臟疾病進展的終末期綜合征[1]。近年來，我國CHF的發病呈現不斷上升趨勢，截至目前，已有CHF病人400萬人左右，2015年中國心血管病報告稱，35～74歲人群CHF患病率為0.9%，其中男性為0.7%，女性稍高為1.0%[2]，死亡率也處于較高水平，4年死亡率高達50%[3]，嚴重危及病人生命。延緩病情進展、提高病人生活質量、降低死亡率是CHF治療的目的。如今，臨床上對于CHF的治療方法較多，目前以血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)、醛固酮受體拮抗劑、β受體阻滯劑等為主，這些藥物對于臨床癥狀改善有一定的效果，但在控制疾病進展方面療效不理想，需要尋找更為有效的方法來治療。有研究認為，CHF的主要病理基礎為心肌細胞凋亡、心肌纖維化[4]，可以視為治療CHF的重要靶點。近年來有研究顯示，中藥在抑制心肌細胞凋亡、逆轉心肌纖維化等方面均具有獨特療效，并因此受到越來越多的關注[5]。本研究探討芪參益氣湯對阿霉素致CHF大鼠心功能及微小核糖核酸133a (miR133a)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 90只6～7周齡清潔級健康雄性Wistar大鼠，體重200～220(212.73±8.12)g，動物許可證號：SCXK(京)2016-0011，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。將大鼠4只/籠置于飼養室內進行適應性飼養，室內溫度20～23 ℃，濕度40%～60%，換氣頻率為8～15次/h，空氣經濾過系統過濾后清潔度10 000級，噪聲在50 dB以下，以標準飼料和無菌過濾水為主，大鼠自由攝入水，每日消毒，更換墊料，飼養時間為5 d。

1.1.2 主要藥品與試劑 芪參益氣湯組方：人參、黃芪、茯苓、淫羊藿各20 g，丹參、白術、葶藶子各15 g，仙鶴草30 g，桂枝、甘草各10 g。藥材購于安國中盛藥材有限公司，由煎藥室分別制成濃度為0.8 g/mL、1.6 g/mL、3.2 g/mL的水煎劑備用。阿霉素[注射用鹽酸多柔比星，規格：每支10 mg，批號：20170102，購自輝瑞制藥(無錫)有限公司]用0.9%氯化鈉溶液稀釋為濃度2 mg/mL的阿霉素溶液使用，現用現配；卡托普利片(規格：每片12.5 mg，批號：20170115，購自江蘇康緣藥業股份有限公司)研碎并溶于0.9%氯化鈉溶液制成濃度為0.25 mg/mL的卡托普利溶液使用，現用現配。10%水合氯醛，購自長沙達爾鋒生物科技有限公司；鹽酸三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)，購自北京孚博生物科技有限公司；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法(TUNEL法)細胞凋亡試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑，購自上海恒斐生物科技有限公司；蛋白裂解液(RIPA)，購自上海研謹生物科技有限公司；二奎啉甲酸法(BCA法)蛋白定量試劑盒，購自深圳子科生物科技有限公司；B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)蛋白多克隆抗體、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)多克隆抗體、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗，英國Abcam公司產品；超敏化學發光底物(ECL)試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司；總RNA提取試劑盒(TRIzol法)、熒光定量?RNA逆轉錄試劑盒，北京百泰克生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器設備 Vevo?2100型小動物彩色多普勒超聲影像系統，加拿大Visual Sonics公司產品；YS1000光學顯微鏡，日本OlyTM7實時熒光定量PCR系統，美國Thermo Fisher Scientific公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模及實驗方法[6]適應性飼養后，按隨機數字表法將所有大鼠分為對照組、模型組、西藥組及中藥低、中、高劑量組，各15只。模型組、西藥組及中藥低、中、高劑量組大鼠予以2 mg/mL的阿霉素溶液0.5 mL/kg尾靜脈注射，對照組大鼠予以0.9%氯化鈉溶液0.5 mL/kg尾靜脈注射，每周注射1次。各組大鼠均注射6周。末次注射后3 d，檢查各組大鼠心臟彩超，若射血分數(EF)不足60%即為成功建立CHF模型，造模失敗或意外死亡的大鼠及時進行補充。成功建立CHF模型后，模型組、對照組分別給予0.9%氯化鈉溶液10 mL/kg，灌胃給藥，每日1次；西藥組給予0.25 mg/mL卡托普利溶液10 mL/kg，灌胃給藥，每日1次；中藥低、中、高劑量組分別給予0.8 g/mL、1.6 g/mL、3.2 g/mL芪參益氣湯10 mL/kg，灌胃給藥，每日1次。各組大鼠均連續給藥28 d。

1.2.2 大鼠心臟超聲檢測 分別于末次給藥后2 d，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg以麻醉大鼠，左側胸口處備皮，采用Vevo?2100型小動物彩色多普勒超聲影像系統測定大鼠左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)、EF、左室短軸縮短率(FS)，連續測量3個心動周期，取平均值。

1.2.3 標本采集與處理[7]心臟超聲檢查結束后，開胸，用4 ℃生理鹽水灌洗心臟，之后將心臟完整取出，洗去殘血，濾紙吸干，取1/2左心室組織置于10%甲醛溶液內固定12 h，常規脫水、透明、石蠟包埋，用切片機制備5 μm石蠟切片；剩余1/2左心室組織采用液氮內速凍，之后置于-70 ℃冰箱內保存，用于蛋白質免疫印跡(Western Blot)及實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)實驗檢測。

1.2.4 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡[8]取1.2.3中制備的心肌組織石蠟切片，常規二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，將切片置于20 μg/mL蛋白酶 K溶液(pH7.4)+ Tris-HCl溶液10 mL內進行細胞通透，室溫反應30 min，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)漂洗3 min×2次；配置TUNEL反應混合液并滴加50 μL進行標記，加封口膜，37 ℃避光反應1 h，PBS沖洗3 min×3次；采用DAB顯色劑顯色，室溫反應30 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加蘇木素溶液進行復染，1 min后自來水沖洗，常規脫水、透明、中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察染色結果、拍照，每張切片選擇5個不重復視野，采用Med6.0數碼醫學圖像分析系統計數凋亡細胞數和總細胞數，細胞凋亡指數(AI)=凋亡細胞數/總細胞數×100%，計算每個視野內的心肌AI，之后取平均值。

1.2.5 Western Blot法檢測大鼠心肌組織Bcl-2蛋白、Caspase-9蛋白表達水平[9]取出1.2.3中凍存的心肌組織，滴加RIPA蛋白裂解液，充分勻漿后，以3 000 r/min速度離心15 min，提取上清液；采用蛋白定量試劑盒檢測總蛋白質含量，電泳儀每個泳道上樣50 μg蛋白，通過SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，電泳條件：濃縮膠80 V、時間30 min，分離膠120 V、時間1 h；采用半干法將分離后的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%牛血清白蛋白溶液搖床封閉3 h；洗膜，滴加1∶1 000稀釋的Bcl-2抗體、Caspase-9抗體及1∶50稀釋的β-actin(內參)，4 ℃過夜；滴加1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗，搖床孵育2 h；超敏ECL試劑盒顯色，之后在暗室內用X光膠片顯影、定影，采用Med6.0數碼醫學圖像分析系統分析目的蛋白條帶灰度值，計算心肌組織Bcl-2蛋白、Caspase-9蛋白相對表達水平。

1.2.6 Real-time PCR法檢測大鼠心肌組織miR 133a、Bcl-2 mRNA及Caspase-9 mRNA表達水平[9]取出1.2.3中凍存的心肌組織，充分研磨勻漿，采用總RNA提取試劑盒(TRIzol法)提取總RNA，并計算總RNA濃度；取總RNA溶液，采用熒光定量?RNA逆轉錄試劑盒配制實時PCR反應體系，將為miR 133a、Bcl-2 mRNA、Caspase-9 mRNA、內參β-actin逆轉錄為cDNA，采用Primer 5.0軟件為miR 133a、Bcl-2 mRNA、Caspase-9 mRNA、內參β-actin設計相應的引物序列，采用實時熒光定量PCR系統進行擴增，并獲得溶解曲線，從而確定各產物濃度，獲得相應Ct值。采用2-ΔΔCt方法計算miR 133a、Bcl-2 mRNA、Caspase-9 mRNA相對表達量，ΔΔCt=實驗組(目的基因Ct值-內參β-actin Ct值)-對照組(目的基因Ct值-內參β-actin Ct值)。

2 結 果

2.1 各組大鼠LVEDD、LVESD、EF、FS比較 與對照組比較，其他各組大鼠LVEDD、LVESD水平升高，EF、FS水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和西藥組大鼠LVEDD、LVESD水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和西藥組大鼠EF、FS水平較高，其中中藥低劑量組<中藥中劑量組<中藥高劑量組和西藥組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠LVEDD、LVESD、EF、FS比較(±s)

與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與中藥低劑量組比較，3)P<0.05；與中藥中劑量組比較，4)P<0.05

2.2 TUNEL法檢測各組大鼠心肌AI結果比較 凋亡陽性細胞的細胞核、胞漿、胞膜上存在被染成棕黃色或黃色的顆粒，其余各組心肌組織存在不同程度的細胞凋亡(見圖1)。定量結果顯示，與對照組比較，其余各組大鼠心肌AI升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和西藥組大鼠心肌AI較低，其中中藥低劑量組>中藥中劑量組>中藥高劑量組、西藥組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠心肌AI比較(±s)

與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與中藥低劑量組比較，3)P<0.05；與中藥中劑量組比較，4)P<0.05

A為對照組；B為模型組；C為中藥低劑量組；D為中藥中劑量組；E為中藥高劑量組；F為西藥組

圖1 TUNEL法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡結果(×200)

2.3 各組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白、Caspase-9蛋白表達水平比較 與對照組比較，其他各組大鼠心肌組織Caspase-9蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和西藥組大鼠心肌組織Caspase-9蛋白表達水平較低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和西藥組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達水平較高，其中中藥低劑量組<中藥中劑量組<中藥高劑量組、西藥組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表3、圖2。

表3 各組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白、Caspase-9蛋白表達水平比較(±s)

與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與中藥低劑量組比較，3)P<0.05；與中藥中劑量組比較，4)P<0.05

A為對照組；B為模型組；C為中藥低劑量組；D為中藥中劑量組；E為中藥高劑量組；F為西藥組

圖2 WesternBlot法檢測各組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白、Caspase-9蛋白表達

2.4 各組大鼠心肌組織miR133a、Bcl-2 mRNA、Caspase-9 mRNA表達水平比較 與對照組比較，各組大鼠心肌組織Caspase-9 mRNA表達水平升高，miR 133a、Bcl-2 mRNA表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和西藥組大鼠心肌組織Caspase-9 mRNA表達水平降低，其中中藥低劑量組>中藥中劑量組>中藥高劑量組和西藥組，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和西藥組大鼠心肌組織miR133a、Bcl-2 mRNA表達水平較高，其中中藥低劑量組<中藥中劑量組<中藥高劑量組和西藥組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠心肌組織miR133a、Bcl-2 mRNA、Caspase-9 mRNA表達水平比較(±s)

與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與中藥低劑量組比較，3)P<0.05；與中藥中劑量組比較，4)P<

0.05

3 討 論

CHF是導致心血管疾病病人死亡的主要原因之一，給病人、家庭及社會造成了沉重的負擔，是目前亟待解決的公共健康問題。CHF的發病機制十分復雜，涉及血流動力學改變、神經內分泌系統激活、心室重塑等多個方面。目前普遍認為，心肌重構是CHF的關鍵病理基礎[10]，而心肌細胞凋亡是心肌重構的重要方面，其一，可造成心肌細胞缺失，心室功能受損而泵血無力，出現CHF；其二，代償性導致左心室肥大、腎素-血管緊張素系統活性增強等；其三，還參與心肌細胞膠原網架、血管床等的變化過程，誘發心室重構。張旭等[11]研究表明，抑制心肌細胞凋亡對于延緩心室重構、改善心功能等具有重要意義。因此，研究干預、阻斷心肌細胞凋亡的新藥是防治CHF的新方向。中醫藥資源豐富，具有通過多靶點、多途徑、多環節發揮作用的特點，在抗心肌細胞凋亡方面也有確切作用[11]，故可稱為CHF新藥研究的主要來源[12]。

在中醫學理論中沒有CHF這一病名，一般將該病歸于“心悸”“喘證”“水腫”“胸痹”等范疇。該病病位在心，為本虛標實之證，本虛指心氣心陽虧虛，標實指血瘀水停，故治療上以益氣溫陽、化瘀逐水為主[12]。本研究采用阿霉素尾靜脈注射的方法建立CHF模型，造模后模型組LVEDD、LVESD水平高于對照組，EF、FS水平低于對照組，可見心臟功能明顯下降，表明成功建立了CHF模型。之后采用不同劑量的芪參益氣湯進行干預，芪參益氣湯中人參、黃芪共為君藥，大補元氣、溫陽利水，臣藥淫羊藿溫補腎陽，桂枝溫通經脈、助陽化氣，助君藥益氣溫陽，佐藥白術燥濕利水，茯苓滲濕利水，葶藶子利水消腫，仙鶴草益氣強心，丹參活血祛瘀，發揮活血化瘀、利水逐飲之效，甘草調和諸藥，全方共奏益氣溫陽、活血利水之效。有研究結果顯示，與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和西藥組大鼠LVEDD、LVESD水平較低，EF、FS水平較高，EF是用來反映心臟泵血功能的常用指標，FS則與EF有相同的意義，LVEDD反映心室舒張末期容積，其水平與EF呈負相關關系，LVESD顯示心室收縮末期容積，數值越大，提示泵血功能越差。本研究結果表明，芪參益氣湯能有效改善心臟功能，減輕CHF病情，而且作用強弱與藥物劑量有關，劑量越大，治療效果越明顯。

TUNEL法檢測結果顯示，與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和西藥組大鼠心肌AI較低，其中中藥低劑量組>中藥中劑量組>中藥高劑量組和西藥組，表明芪參益氣湯對于CHF大鼠的心肌細胞凋亡有抑制作用。鄧建南等[13]研究認為，人參中的人參皂苷Rb1成分能夠通過調節凋亡相關蛋白和mRNA表達水平，來抑制心肌細胞凋亡，對抗心力衰竭；沈麗娟等[14]研究表明，黃芪甲苷可以通過降低氧自由基水平，促進Bcl-2表達同時抑制Bax表達來發揮作用，抑制阿霉素誘導的大鼠心肌細胞凋亡；李富饒等[15]研究認為，淫羊藿總黃酮也能抑制凋亡相關蛋白Caspse-9、Caspase-3等表達，還能減輕心肌細胞DNA片段化，減少心肌細胞凋亡，改善CHF大鼠心功能。上述活性成分均可能存在于芪參益氣湯中，證實了芪參益氣湯抑制心肌細胞凋亡的功效，這可能也是芪參益氣湯改善CHF模型大鼠心臟功能的主要機制。

微小RNA是由21～25個核苷酸組成的不編碼蛋白質的小分子RNA，參與多種重要的生物進程，miR 133a即是其中一員。miR133a主要分布于心肌組織，屬于心臟特異性微小RNA，與CHF發生發展關系密切，上調miR133a有助于保護CHF[16]。有研究認為，miR133a具有抗凋亡效應，能夠降低心肌細胞凋亡水平。Caspase-9和Bcl-2屬于miR133a調節凋亡的效應蛋白，Caspase-9屬于細胞凋亡的起始者，可以通過切割特定蛋白造成細胞凋亡，而miR133a對Caspase-9表達有抑制作用[17]；Bcl-2則屬于細胞存活促進因子，其可以抑制細胞色素C釋放，減少細胞凋亡，上調Bcl-2有助于保護心肌細胞。本研究結果顯示，與模型組比較，中藥低、中、高劑量組和西藥組大鼠心肌組織miR133a、Bcl-2 mRNA及Bcl-2蛋白表達水平較高，Caspase-9 mRNA及Caspase-9蛋白表達水平較低，表明芪參益氣湯有促進miR133a表達上調的作用，并因此引起Caspase-9表達下調和Bcl-2表達上調，從而發揮抗心肌細胞凋亡的作用。

綜上所述，芪參益氣湯能明顯改善CHF大鼠的心功能，而且劑量越高效果越好，其作用可能與促進miR133a表達，調節miR133a下游Bcl-2、Caspase-9蛋白表達水平，抑制心肌細胞凋亡有關。