田旋花EPSPS基因表達(dá)特征及草甘膦對(duì)其表達(dá)的影響

黃兆峰 白薇薇 周欣欣 黃紅娟 姜翠蘭 張朝賢 魏守輝

摘要 采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR測(cè)定了田旋花不同組織、不同葉齡的EPSPS基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量以及草甘膦對(duì)EPSPS基因相對(duì)表達(dá)量的影響。結(jié)果表明：田旋花EPSPS基因在不同組織表達(dá)量差異顯著，在葉的表達(dá)量高于莖和根;該基因在9葉期的表達(dá)量最高，是3葉期的1.5倍;在草甘膦處理后，田旋花EPSPS基因的表達(dá)量先升高后降低，在處理后24 h達(dá)最大值。隨草甘膦劑量增加，該基因的表達(dá)量升高。研究結(jié)果可為深入解析田旋花對(duì)草甘膦耐藥性機(jī)理提供參考。

關(guān)鍵詞 田旋花; 草甘膦; EPSPS; 表達(dá)

中圖分類號(hào)： S 482.4， S 451.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018372

5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合成酶（EPSPS， EC 2.5.1.19）是莽草酸途徑中的關(guān)鍵酶，莽草酸-3-磷酸（S3P）和烯醇式丙酮酸（PEP）在EPSPS的催化下轉(zhuǎn)化為5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸（EPSP）[1]。草甘膦是目前應(yīng)用最為廣泛的廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑[2]。它的作用方式是抑制EPSPS活性，阻斷芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的生物合成，從而達(dá)到除草的目的[3]。由于草甘膦具有高效、低毒、低殘留、無(wú)污染等優(yōu)良特性，使其迅速成為耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物的首選藥劑。隨著耐草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的大面積種植和草甘膦的廣泛使用，抗/耐草甘膦雜草將不斷發(fā)生與發(fā)展，給農(nóng)田雜草治理帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[45]。到目前為止，全球已有42種雜草對(duì)草甘膦產(chǎn)生了抗藥性[6]。

雜草對(duì)草甘膦的抗藥性可以分為靶標(biāo)抗性和非靶標(biāo)抗性兩方面[7]。其中，靶標(biāo)EPSPS突變或過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的抗藥性占主要部分。

靶標(biāo)EPSPS突變。草甘膦靶標(biāo)EPSPS基因關(guān)鍵部位核苷酸被取代，導(dǎo)致氨基酸類型改變，進(jìn)而引起EPSPS構(gòu)象發(fā)生變化，致使草甘膦與EPSPS結(jié)合能力下降，最終導(dǎo)致藥效降低[89]。牛筋草Eleusine indica、多花黑麥草Lolium multiflorum的EPSPS 106位氨基酸由脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸（Pro-106-Ser）或蘇氨酸（Pro-106-Thr），導(dǎo)致對(duì)草甘膦抗藥性[1011]。抗草甘膦牛筋草種群EPSPS同時(shí)存在102位（Thr-102-Ile）和106位（Pro-106-Thr）兩個(gè)氨基酸取代，該種群表現(xiàn)出對(duì)草甘膦高抗性[1213]。

EPSPS過(guò)表達(dá)。EPSPS 基因拷貝數(shù)增加，過(guò)表達(dá)的EPSPS提供了充足的酶來(lái)滿足正常生長(zhǎng)發(fā)育的需要，從而表現(xiàn)出對(duì)草甘膦抗藥性[1415]。長(zhǎng)芒莧Amaranthus palmeri、意大利黑麥草Lolium perenne ssp.multiflorum、地膚Kochia scoparia等雜草的EPSPS基因在多個(gè)染色體上成倍擴(kuò)增， 這些雜草抗藥性均是由于靶標(biāo)EPSPS過(guò)表達(dá)導(dǎo)致[1517]。耐草甘膦的狗肝菜Dicliptera chinensis和麥冬Ophiopogon japonicus經(jīng)草甘膦處理后，EPSPS在轉(zhuǎn)錄水平上提高，過(guò)表達(dá)的EPSPS解除了草甘膦的限制，增加了對(duì)草甘膦的耐藥性[1819]。

田旋花Convolvulus arvensis L.屬旋花科旋花屬雜草，該雜草具有龐大的根系，以地下根芽或種子進(jìn)行繁殖，生命力極強(qiáng)，防除困難[20]。已被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織列為世界上18種危害最嚴(yán)重的雜草之一。同時(shí)，田旋花是最早報(bào)道的對(duì)草甘膦具有天然耐藥性的雜草之一[21]，但其耐藥性機(jī)制至今尚不明確。前期的研究發(fā)現(xiàn)田旋花EPSPS并無(wú)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)突變[22]，由于EPSPS過(guò)表達(dá)是草甘膦抗/耐藥性的重要機(jī)理之一，為探究EPSPS過(guò)表達(dá)是否在耐草甘膦田旋花中存在，本試驗(yàn)以田旋花為試材，比較了不同組織EPSPS基因表達(dá)差異，分析了不同葉齡田旋花EPSPS基因mRNA相對(duì)表達(dá)量以及草甘膦對(duì)EPSPS基因表達(dá)的影響，以期為闡明田旋花對(duì)草甘膦耐藥性機(jī)理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

田旋花種子采自北京市海淀區(qū)上莊鎮(zhèn)（116°17′E;40°13′N）。種子經(jīng)80%硫酸浸泡30 min，洗凈后清水浸泡24 h，于恒溫箱中28℃催芽12 h。選萌發(fā)長(zhǎng)勢(shì)相同的種子，每個(gè)花盆（8 cm ×10 cm）中播種6粒，置于溫室內(nèi)培養(yǎng)（25℃/22℃，相對(duì)濕度40%，光照12 h）。待出苗后2葉期進(jìn)行間苗，每盆保留4株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。研究EPSPS組織表達(dá)差異時(shí)，在田旋花子葉完全展開(kāi)后取子葉樣品，在田旋花6葉期時(shí)取根、莖和葉（植株頂部第1～3片葉）樣品;研究田旋花不同葉齡EPSPS表達(dá)差異時(shí)，取植株頂部第1～3片葉;研究草甘膦對(duì)EPSPS表達(dá)影響時(shí)， 將田旋花幼苗培養(yǎng)至6葉期，用不同劑量的草甘膦461.25、922.5、1 845 g/hm2進(jìn)行莖葉噴霧處理，分別在處理后12、24、36和48 h取樣，取植株頂部第1～3片葉（約200 mg），取樣后用液氮迅速冷凍，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)樣品或處理設(shè)生物學(xué)重復(fù)3次。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）登錄的田旋花EPSPS （EU698030）和18S rRNA（AJ236013.1）基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物EPSPS-f 和EPSPS-r及18S rRNA-f和18S rRNA-r（表1）。上述引物由北京六合華大公司合成。

1.3 田旋花總RNA提取及cDNA的合成

按照離心柱式植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技公司）的說(shuō)明提取田旋花不同組織及草甘膦處理后葉片的總RNA。凝膠電泳檢測(cè)合格后，用于cDNA的合成。以總RNA為模板，用RT-PCR試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 熒光定量PCR分析EPSPS表達(dá)

采用ABI7500 實(shí)時(shí)定量 PCR 儀，以cDNA 為模板，按照SYBR Green PCR Master Mix使用說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：12.5 μL 2 ×SYBR Green，1 μL cDNA，0.5 μL引物，補(bǔ)水至總體積25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 15 s，62℃ 25 s，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和熔解曲線。Ct值取平均值。以ΔΔCt 法來(lái)計(jì)算EPSPS的表達(dá)量。18S rRNA在不同組織及草甘膦處理后表達(dá)穩(wěn)定，故該基因被選作內(nèi)參基因[22]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田旋花不同組織EPSPS基因表達(dá)特征

以田旋花根、莖、葉和子葉為試驗(yàn)材料，測(cè)定了EPSPS基因在不同組織的表達(dá)特征。如圖1所示，EPSPS基因在田旋花不同組織中表達(dá)量差異顯著。在葉中表達(dá)量最高，顯著高于在其他組織中的表達(dá)量，其次是莖和子葉，在根中的表達(dá)量最低。EPSPS基因在莖和子葉中的表達(dá)量與在根中的表達(dá)量差異也達(dá)顯著水平。

2.2 EPSPS基因在田旋花不同葉齡表達(dá)特征

田旋花在不同葉齡分別取頂部第1～3片葉用于EPSPS基因表達(dá)量檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，田旋花EPSPS基因在3、6、9、12葉期表達(dá)量有差異。在9葉期的相對(duì)表達(dá)量最高，是表達(dá)量最低的3葉期的1.5倍，EPSPS基因在田旋花9葉期和12葉期的表達(dá)量差異不顯著。

2.3 草甘膦處理對(duì)田旋花EPSPS基因表達(dá)的影響

以不同劑量草甘膦處理過(guò)的田旋花葉片（6葉期時(shí)頂部第1～3片葉）為試材，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了草甘膦對(duì)EPSPS基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，田旋花EPSPS基因在草甘膦（922.5 g/hm2）處理后呈先升高后降低的趨勢(shì)，在處理后24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，約為未處理時(shí)的12倍，之后逐漸下降（圖3）。隨著草甘膦劑量的提高，田旋花EPSPS基因表達(dá)呈增加趨勢(shì)。

3 討論

目前，化學(xué)除草仍是世界各國(guó)防控雜草的主要方式之一。過(guò)度依賴化學(xué)除草不但造成抗藥性雜草的發(fā)生和發(fā)展，而且會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響。在倡導(dǎo)農(nóng)藥減量、環(huán)境保護(hù)和綠色發(fā)展的背景下，如何防控抗藥性雜草的發(fā)生和發(fā)展是當(dāng)前雜草科學(xué)研究的重要內(nèi)容。而闡明雜草對(duì)除草劑抗藥性的內(nèi)在機(jī)制，尤其是解析雜草對(duì)世界第一大除草劑草甘膦的抗/耐藥性機(jī)制是雜草抗藥性研究的首要任務(wù)。

為闡明田旋花對(duì)草甘膦的天然耐藥性機(jī)制，作者在前人研究的基礎(chǔ)上推測(cè)田旋花對(duì)草甘膦耐藥性可能與靶標(biāo)EPSPS基因過(guò)表達(dá)相關(guān)。植物不同器官對(duì)芳香族氨基酸的需求是不同的，而芳香族氨基酸是莽草酸途徑中的產(chǎn)物，EPSPS酶是莽草酸途徑中的關(guān)鍵酶，因此EPSPS基因在不同組織器官中的表達(dá)量可能不一致[23]。本研究利用熒光定量方法對(duì)田旋花EPSPS基因在不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，EPSPS基因在田旋花根、莖、葉和子葉均有表達(dá)，說(shuō)明EPSPS基因的表達(dá)不具有組織特異性。這一結(jié)果與在薤白[24]中EPSPS的表達(dá)相一致。田旋花EPSPS基因在葉中表達(dá)量最高，在陸地棉[23]中也得到了同樣的結(jié)果。

在外界因子脅迫下，植物體感受外界脅迫信號(hào)而啟動(dòng)或關(guān)閉某些基因的表達(dá)，以抵御逆境的危害，保證植物細(xì)胞的正常生理功能和植物體生長(zhǎng)發(fā)育。研究表明：植物體內(nèi)EPSPS基因的過(guò)量表達(dá)可以提高對(duì)草甘膦的耐受性[1517]。棉花品系Y18在受到草甘膦的脅迫作用時(shí)，植物體內(nèi)的EPSPS酶表達(dá)量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)[25]。Shyr等[26] 發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜在含有草甘膦的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，EPSPS基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯增加。此外在狗肝菜和麥冬等雜草中均發(fā)現(xiàn)了草甘膦處理導(dǎo)致EPSPS基因表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象[1819]。但是，長(zhǎng)芒莧的EPSPS基因表達(dá)不受草甘膦處理的影響[15]。本研究表明：草甘膦處理可以引起田旋花EPSPS表達(dá)量的提高，并且隨著草甘膦劑量的增加，EPSPS表達(dá)量也升高，這可能是田旋花對(duì)草甘膦耐藥性的分子機(jī)制。

基因的表達(dá)調(diào)控受啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)。田旋花在草甘膦處理后，EPSPS基因上調(diào)表達(dá)可能與啟動(dòng)子順式作用元件或相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。從EPSPS基因啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子入手探究田旋花耐草甘膦更深層次的機(jī)理將是下一步研究重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1] HERRMANN K M， WEAVER L M. The shikimate pathway[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology， 1999， 50：473503.

[2] 張朝賢，房峰，張猛，等.草甘膦應(yīng)用現(xiàn)狀及雜草抗性研究與治理對(duì)策[J].中國(guó)農(nóng)藥，2011（8）： 2226.

[3] STEINRUCKEN H C， AMRHEIN N. The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5-enolpyruvyl shikimic acid-3-phosphate synthase [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 1980， 94：12071212.

[4] 李香菊，崔海蘭. 轉(zhuǎn)基因耐草甘膦作物的環(huán)境安全性[J].植物保護(hù)， 2011，37（6）：3843.

[5] 張朝賢，黃紅娟，崔海蘭， 等. 抗藥性雜草與治理[J].植物保護(hù)， 2013， 39（5）：99102.

[6] HEAP I. The international survey of herbicide resistant weeds[EB/OL]. www.weedscience.com. Accessed Aug 20， 2018.

[7] POWLES S B， YU Q. Evolution in action： plants resistant to herbicides [J]. Annual Review of Plant Biology， 2010， 61： 317347.

[8] CHEN Jingchao， HUANG Hongjuan， ZHANG Chaoxian， et al. Mutations and amplification of EPSPS， gene confer resistance to glyphosate in goosegrass （Eleusine indica） [J].Planta，2015，242（4）：859868.

[9] KOO D H， JUGULAM M， PUTTA K， et al. Gene duplication and aneuploidy trigger rapid evolution of herbicide resistance in common waterhemp [J]. Plant Physiology， 2018， 176（3）：19321938.

[10]BAERSON S R， RODRIGUEZ J， TRAN M， et al. Glyphosate-resistant goosegrass identification of a mutation in the target enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase[J]. Plant Physiology， 2002， 129： 12651275.

[11]FIDEL G T， JAVIER G H FRANCISCO B， et al. Target site mutation and reduced translocation are present in a glyphosate-resistant Lolium multiflorum Lam. biotype from Spain[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2012， 58：1622.

[12]YU Qin， JALALUDIN A， HAN Heping， et al. Evolution of a double amino acid substitution in the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase in Eleusine indica conferring high-level glyphosate resistance [J]. Plant Physiology，2015，167（4）：1440.

[13]CHEN Jingchao， HUANG Hongjuan，WEI Shouhui， et al. Investigating the mechanisms of glyphosate resistance in goosegrass （Eleusine indica （L.） Gaertn.） by RNA sequencing technology [J]. Plant Journal， 2017， 89（2）：407.

[14]POWLES S B. Gene amplification delivers glyphosate-resistant weed evolution [J]. PNAS， 2010， 107（3）： 955956.

[15]GAINES T A， ZHANG W， WANG D， et al. Gene amplification confers glyphosate resistance in Amaranthus palmeri [J]. PNAS， 2010，107：10291034.

[16]SALAS R A， DAYAN F E， PAN Z Q，et al. EPSPS gene amplification in glyphosate-resistant Italian ryegrass （Lolium perenne ssp. multiflorum） from Arkansas [J]. Pest Management Science，2012， 68： 12231230.

[17]WIERSMA A T， GAINES T A， PRESTON C， et al. Gene amplification of 5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase in glyphosate-resistant Kochia scoparia [J]. Planta， 2015， 241（2）：463474.

[18]YUAN C I， CHAING M Y， CHEN Y M. Triple mechanisms of glyphosate-resistance in a naturally occurring glyphosate-resistant plant Dicliptera chinensis [J]. Plant Science，2002， 163（3）： 543554.

[19]MAO Chanjuan， XIE Hongjie， CHEN Shiguo， et al. Multiple mechanism confers natural tolerance of three lilyturf species to glyphosate [J]. Planta， 2016， 243（2）：321335.

[20]JAMES H， WESTWOOD C N， YERKES F P， et al. Absorption and translocation of glyphosate in tolerant and susceptible biotypes of field bindweed （Convolvulus arvensis）[J]. Weed Science， 1997， 45： 658663.

[21]HUANG Zhaofeng， ZHANG Chaoxian， HUANG Hongjuan， et al. Molecular cloning and characterization of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene from Convolvulus arvensis L [J].Molecular Biology Reports，2014，41（4）：20772084.

[22]張猛. 田旋花（Convolvulus arvensis L.）對(duì)草甘膦耐藥性機(jī)理研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2011.

[23]童旭宏， 吳玉香， 祝水金. 陸地棉EPSPS基因的克隆及其組織特異性表達(dá)分析[J].棉花學(xué)報(bào)， 2009， 21（4）： 259264.

[24]蔣向， 戴雄澤，李育強(qiáng)， 等. 薤白EPSPs基因在不同組織表達(dá)的半定量分析[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2007（5）： 542545.

[25]劉東軍，張銳，郭三堆，等.棉花品系Y18在草甘膦脅迫下的epsps基因表達(dá)分析研究[J].中國(guó)生物工程雜志，2008（10）：5559.

[26]SHYR Y Y，HEPBURN A G，WIDHOLM J M.Glyphosate selected amplification of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene in cultured carrot cells [J].Molecular and General Genetics，1992，232（3）：377382.

（責(zé)任編輯：田 喆）