去甲斑蝥素對人真皮淋巴管內皮細胞體外三維培養淋巴管生成的影響及其機制

徐永良，孫平，李明秋，趙微

牡丹江醫學院，黑龍江牡丹江 157000

研究報道，腫瘤擴散主要是通過腫瘤細胞通過淋巴管向淋巴結轉移而實現的[1]。隨著現代醫療衛生事業的不斷發展，腫瘤血管生成抑制劑研究實現了由實驗階段向臨床試驗的轉變，取得了一定的成果。尤其是特異性人真皮淋巴管內皮細胞標記物（HDLEC）被發現，將腫瘤與新生淋巴管研究又推向了一個新的階段，該研究有望為抗腫瘤新生淋巴管治療提供更多的可能性，推動腫瘤生物治療新模式的發展[2]。當前，關于淋巴管生成過程及機制尚不明確。作為治療腫瘤疾病的傳統中藥，去甲斑蝥素（NCTD）抗淋巴管生成作用機制需要進一步研究[3]。該次研究采用HDLEC三維培養對淋巴管生成過程進行模擬，探究其對淋巴管生成因子以及基因表達的影響，總結其抗淋巴管生成的分子機制，以期為腫瘤抗淋巴管生成治療的實現提供可靠的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究所用HDLEC細胞購自通派(上海)生物科技有限公司；人纖維蛋白原購自深圳市衛武光明生物制品有限公司；兔抗人VEGF-C抗體由上海萬疆生物技術有限公司提供，見表1。

表1 材料及試劑來源情況

1.2 纖維蛋白凝膠的制備及細胞培養

選擇3 mg/mL人纖維蛋白原與50 U/mL人凝血酶，采用PBS進行溶解，纖維蛋白凝膠的制備在6孔培養板中進行，分別在其中按照先后順序加入500 μL纖維蛋白原、100 μL內皮細胞培養液以及10 μL凝血酶溶液，凝固后，在37℃溫度環境下，將上述放置于95%空氣飽和濕度、5%CO2培養箱中進行培養，時間以30 min為宜，直至纖維蛋白原凝膠呈現為膠凍狀。提取300 μL培養好的HDLEC懸液注入凝膠表面，在室溫狀態下靜置1 h，然后在其中加入2 mL內皮細胞培養液，將培養箱環境設置為95%空氣飽和濕度、5%CO2，溫度以37℃為宜，進行培養，每2 d對培養液進行更換，采用倒置光顯微鏡對細胞生長情況以及體外淋巴管予以觀察，并做好相應的記錄。培養1周左右，將HDLEC隨機分為NCTD組與空白對照組，其中NCTD組加入1/3IC50NCTD40nM，持續培養24 h，記錄其形態變化情況。對HDLEC進行1周培養，然后隨機分為NCTD組與空白對照組，24 h后對HDLEC體外模擬淋巴管生成情況予以免疫細胞化學檢測、Westen blot以及qPCR測定。

1.3 qPCR檢測

嚴格按照Trizol試劑盒說明進行檢測，首先將細胞總RNA進行提取，在cDNA逆轉錄試劑盒指導作用下，完成第一鏈cDNA的合成，然后實施PCR擴增，并給予定量PCR 檢測。 擴增反應條件如下：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃30 s，前后共進行40個循環。數據分析采用北京豫維科技有限公司提供的Verilog序列檢測系統自帶軟件，所有檢測樣品均配備兩份。樣本mRNA相對表達量以及測定CT值內部參照選擇GAPDH，基因表達量的計算采用比較循環閾值的方法。

1.4 Western blot試驗

按照試劑盒說明實施操作，將細胞進行裂解，并將蛋白提取，放置于RIPA裂解緩沖液中，其中包含了1%脫氧膽酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉、50 mM Tris以及150 mM氯化鈉，對兔抗人VEGF-C、VEGF-D以及VEGFR-3抗體實施免疫印跡試驗。蛋白條帶顯示采用Licor Odyssey雙色紅外成像系統（北京恒安瑞豐科技有限公司）。在計算與GAPDH相對的熒光強度時采用的是Odyssey軟件。VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達積分光密度采用Image Pro Plus軟件予以確定。

1.5 免疫細胞化學染色

采用S-P法進行免疫細胞化學染色。首先于玻璃蓋玻片上放置浸漬35 mm培養皿纖連蛋白，然后再蓋玻片上接種HDLEC。將其隨機分為NCTD組與空白對照組，作用時間為24 h，將蓋玻片取出，按照1：1的比例對甲醇與丙酮溶液進行固定，在常溫狀態下自然風干，然后保存于-20℃冰箱環境中。按照S-P法的要求對細胞片實施免疫細胞化學染色，陽性判斷標準：細胞質內呈現出棕黃色顆粒。采用Image Pro PLus對染色結果進行測定，記錄積分光密度值。

1.6 統計方法

研究所有數據采用SPPSS 22.0統計學軟件上進行，所有計數資料采用百分比（%）表示，組間差異比較采用χ2檢驗，計量資料用（±s）表示，組間差異性用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NCTD組與空白對照組淋巴管生成情況比較

空白對照組HDLEC細胞多以橢圓、圓形為主，NCTD組少部分為管狀結構。細胞形態隨著時間延長表現為離壁、浮起。采用顯微鏡隨機選取5個視野進行觀察，取值3次，結果顯示NTCD組淋巴管生成個數較空白對照組少，差異有統計學意義（P＜0.05），見表 2。

表2 NCTD組與空白對照組淋巴管生成情況比較[（±s），個]

表2 NCTD組與空白對照組淋巴管生成情況比較[（±s），個]

組別淋巴管生成個數N C T D組空白對照組t值P值1 0.9 2±2.3 5 6 7.2 9±5.3 6 2 3.5 5 2<0.0 5

2.2 NCTD對淋巴管生成中 VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達的影響

經過免疫細胞化學染色及Western blot試驗，可以發現NCTD組三維培養淋巴管中的VEGF-C以及VEGF-D蛋白呈現出明顯的下降趨勢，且對VEGF-C、VEGF-D以及VEGFR-3基因表達呈現出降低趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05），見表 3。

表3 NCTD對淋巴管生成中VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達的影響[（±s），%]

表3 NCTD對淋巴管生成中VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達的影響[（±s），%]

組別 V E G F-C V E G F-D V E G F R-3 N C T D組空白對照組t值P值2.4 3±0.1 2 7.4 5±0.1 4 8.4 9 3<0.0 5 1 6.0 9±1.2 4 2 7.2 1±1.2 6 1 0.2 7 5<0.0 5 0.9 6±0.0 1 3.4 2±0.0 3 6.4 3 2<0.0 5

3 討論

研究顯示，淋巴管生成在胚胎期淋巴系統發育及淋巴管再生中發揮這極為重要的作用[4-5]。通常，血管生成與淋巴管生成是同步進行的，當腫瘤中有血管生成，可以判斷腫瘤中也或多或少含有淋巴管生成[6]。以往有學者在動物模型中證實了腫瘤淋巴管的生成，且發現NCTD能夠對膽囊及膀胱腫瘤細胞VEGF-C、VEGF-D以及VEGFR-3基因表達產生抑制作用[7]。該次研究在完成構建HDLEC體外培養淋巴管生成模型及功能化表征的基礎之上，進一步采用生化分析及熒光檢測方法實時跟蹤藥物的活性效應。在體外培養的淋巴管體系加入模型抗腫瘤藥物，進行24 h藥物處理,參照傳統的細胞培養考察淋巴管內皮細胞的增殖（與未處理的細胞比較）和活性情況及淋巴管生成的影響。利用Western blot試驗、免疫化學細胞染色檢測藥物的代謝過程進行藥物分析，探討體內過程影響藥物抑制淋巴管生成的機理，進而完成基于淋巴管生成的抗腫瘤藥物評價，可以發現淋巴管狀結構形成與HDLEC遷移、增殖等有著密不可分的聯系。學者袁小建等人[8]在研究中發現NCTD對HDLEC的形態和細胞的增殖具有顯著的抑制和直接殺傷作用，并能促進、誘導HDLEC凋亡，且0.001 25 mg/mL組越過刮除線細胞數達到（32.5±4.3）個，高于 0.005 mg/mL 組（56.3±5.2）個（P＜0.05），其作用隨 NCTD濃度而加強 (P＜0.01)。從該次研究結果看，NCTD組淋巴管生成數量少于空白對照組[（10.92±2.35）個vs（67.29±5.36）個]，且隨著時間延長 HDLEC 細胞呈現出浮起、固縮碎裂等，細胞出現凋亡、壞死現象，證實了NCTD對HDLEC三維培養體外模擬淋巴管生成的抑制作用，與此同時，NCTD還能夠抑制已經形成的淋巴管狀結構，并對其進行破壞，與以往學者研究結果一致。盡管當前NCTD在臨床上已被廣泛應用于抗腫瘤治療，然而其在抗腫瘤淋巴管生成方面卻鮮有報道[9]。該次研究構建了HDLEC體外模擬淋巴管生成模型，采用Wesren bolt qPCR等檢測，結果顯示NCTD能夠對淋巴管生成期間的VEGF-C、VEGF-D以及VEGFR-3基因表達起到下調作用，考慮與NCTD對淋巴管內皮細胞增殖、遷移作用有關[10]。但NCTD能夠對惡性腫瘤引起的淋巴管生成起到抑制作用還需要進一步試驗驗證。在今后研究中可著重探討NCTD與VEGFR-3抗體在腫瘤淋巴管生成中是否存在協同作用，為腫瘤抗淋巴管治療提供借鑒。

綜上所述，NCTD能抑制 HDLEC的增殖、遷徙，并對其有直接殺傷作用和凋亡誘導作用，這可能是NCTD抗淋巴管生成作用的基礎。