神香草揮發油對急性炎癥的作用*

谷會青，張洪平，侯亞申，伊合帕爾·吐依洪

(1.新疆醫科大學第四臨床醫學院，烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學附屬中醫醫院呼吸病研究重點實驗室，烏魯木齊 830000)

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 神香草于2014年7月采自新疆維吾爾自治區阿勒泰市小東溝，經新疆維吾爾自治區中醫醫院藥學部趙翡翠主任中藥師鑒定為硬尖神香草(HyssopuscuspidatusBoriss)的全草。阿司匹林腸溶片(Bayer Health Care Manufacturing S.r.l，批號：BJ32094)，MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20170418)，二甲苯(天津市百世化工有限公司，批號：20160412)，N-萘乙胺鹽酸鹽[西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，批號：N9125-10G]，無水對氨基苯磺酸[西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，批號：SLBC0284V]，青霉素鈉(北京悅康凱悅制藥有限公司，批號：06160116)，氫氧化鉀(天津市大茂化學試劑廠，批號：20091017)，甲醇(天津市百世化工有限公司，批號：20161202)。

1.2實驗動物 昆明種小鼠50只，體質量 18～22 g，雌雄各半，清潔級，購于新疆維吾爾自治區疾病控制中心，動物使用許可證號：SYXK(新)2016-002；實驗動物合格證號：65000200001137。動物飼養于溫度(23±2)℃、相對濕度60%～65%、12 h明暗交替環境，分籠飼養，標準飼料，自由進食飲水。

1.3HEO的制備 參考文獻[12]，采用干燥的神香草，全草切成細段，按《中華人民共和國藥典》(第四部，2015年版)2204項下揮發油測定法甲提取揮發油，稱取藥材，收集揮發油用無水硫酸鈉除水，揮發油得率為0.18%，放在干燥遮光玻璃瓶里用封口膜密封，4 ℃保存。

1.4HEO對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 昆明種小鼠按照隨機數字表法分成4組：模型對照組 (0.9%氯化鈉溶液)、阿司匹林組 (200 mg·kg-1)、HEO大劑量組(0.4 mL·kg-1)、HEO小劑量組(0.2 mL·kg-1)，每組10只；灌胃給藥 每天1次，連續 7 d，灌胃體積均為0.02 mL·g-1，末次給藥后 30 min，各組小鼠均在小鼠右耳前、后面均勻涂二甲苯50 μL致炎，1 h后取血，將收集血液放在EP管中3500 r·min-1離心10 min(r=15 cm)，將上清液轉移到另一個EP管放在-85 ℃冰箱備用。沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑9 mm打孔器分別在兩耳的同一部位打下圓耳片，精密稱質量，以左、右耳質量差為腫脹度，以此判斷HEO對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響；耳腫脹度 (mg)=右耳片質量-左耳片質量；腫脹抑制率 (%)= [(模型對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型對照組平均腫脹度]×100%[13]。

1.5硫代巴比妥酸(TBA)法對小鼠血清中MDA含量進行檢測 將實驗小鼠處死取血后，經離心機離心后得到血清樣本。按照試劑盒說明書對各個試劑進行處理后得到試劑一、試劑二應用液、試劑三應用液，再按照操作步驟在空白管先后分別加入0.1 mL無水乙醇和試劑一、1.5 mL試劑二和試劑三應用液；在標準管中加入0.1 mL標準品(四乙氧基丙烷)代替空白管的無水乙醇，其他試劑與空白管相同；測定管中加入0.1 mL測試樣品代替標準管中的標準品，其他試劑與標準管中的試劑相同。旋渦混勻后，用保鮮膜將試劑管扎緊再刺一小洞，95 ℃水浴40 min，用冷水冷卻后3500 r·min-1離心10 min(r=15 cm)，取上清液約0.8 mL在532 nm處測吸光度(A值)。計算公式：血清中MDA含量(nmol·mL-1)=(測定A值-空白A值)/(標準A值-空白A值)×標準品濃度(10 nmol·mL-1)×樣品稀釋前的稀釋倍數[14]。

1.6Griess法檢測小鼠血清中NO含量 將實驗小鼠處死取血后，經離心機離心后得到血清樣本[15]。然后按照相關資料分別配制正確的試劑，10 mmol·mL-1亞硝酸鈉標準液，試劑A(用85%濃磷酸0.6 mL、去離子水7 mL、與無水對氨基苯磺酸0.1 g進行混勻，最后定容至10 mL)試劑B(N-1-萘乙二胺鹽0.01 g，酸鹽用去離子水定容至10 mL)。按照操作步驟分別進行標準品濃度稀釋(稀釋濃度分別是6.250，3.125，1.560，0.780，0.390和0.295 μmol·mL-1)，加樣，分別加入試劑A與試劑B，最后在540 nm波長檢測A值。以標準濃度為橫坐標，A值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品A值與標準物濃度求出直線回歸方程，NaNO2含量計算公式X=0.932 3Y-0.535 4，R2=0.998 6。計算樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為實際樣品濃度。

1.7紫外分光光度法檢測小鼠血清中PGE2含量 將實驗小鼠處死取血后，經離心機離心后得到血清樣本。然后按照相關資料分別配制正確的試劑，0.5 mol·L-1氫氧化鉀甲醇溶液。取小鼠血清0.5 mL，然后加入0.5 mol·L-1氫氧化鉀甲醇溶液1 mL，混勻后50 ℃水浴異構化20 min，取出稍冷卻后2000 r·min-1離心3 min(r=15 cm)，取上清液，紫外分光光度計278 nm處測定吸光度值[16]。由于小鼠灌胃操作失誤及部分小鼠采血量較少造成樣本量有所減少。

2 結果

2.1HEO對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 致炎后各組小鼠右耳立刻出現明顯紅腫現象，阿司匹林組、HEO大劑量組與小劑量組與模型對照組比較都有很明顯的抗炎作用，HEO大劑量組平均腫脹抑制率為57.96%；HEO在實驗濃度范圍內可明顯降低二甲苯致小鼠的耳廓腫脹度 (P<0.01)。見圖1。

A.模型對照組；B.阿司匹林組；C.HEO大劑量組；D.HEO小劑量組；與模型對照組比較，*1P<0.01。圖1 4組小鼠耳腫脹度比較A.model control group ;B.aspirin group ;C.high-dose HEO group ;D.low-dose HEO group ;Compared with model control group，*1P<0.01.Fig.1 Comparison of ear swelling among four groups of

2.2HEO對二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型小鼠血清MDA含量的影響 與模型對照組比較，阿司匹林組和HEO大劑量組、小劑量組的MDA含量明顯降低，藥物處理組與模型對照組間的差異有統計學意義(P<0.01)，HEO大、小劑量組與阿司匹林組差異不明顯(P>0.05)。HEO可降低急性炎癥模型小鼠血清中的MDA含量，見圖2。

2.4HEO對急性炎癥模型大鼠血清PGE2含量的影響 與模型對照組比較，HEO大、小劑量組與阿司匹林組小鼠血清PGE2含量均明顯降低(P<0.05)，見圖4。

A.模型對照組；B.阿司匹林組；C.HEO大劑量組；D.HEO小劑量組；與模型對照組比較，*1P<0.01。圖2 4組小鼠血清中MDA含量比較A.model control group ;B.aspirin group ;C.high-dose HEO group ;D.low-dose HEO group ;Compared with model control group，*1P<0.01.Fig.2 Comparison of serum MDA content among four groups of

A.模型對照組；B.阿司匹林組；C.HEO大劑量組；D.HEO小劑量組；與模型對照組比較，*1P<0.05。圖3 4組小鼠血清中NO含量比較A.model control group ;B.aspirin group ;C.high-dose HEO group ;D.low-dose HEO group ;Compared with model control group，*1P<0.05.Fig.3 Comparison of serum NO content among four groups of

3 討論

炎癥是具有血管系統的組織對致炎因子的侵入所發生的防御反應，在一般的炎癥反應過程中，由于炎癥遞質的刺激，血管通透性增加引起血管內容物滲入到組織間隙，以毛細血管擴張和通透性增高、滲出和組織腫脹主；隨之白細胞從血液滲透到組織間隙，以白細胞聚集為主；最后是肉芽腫的形成、纖維組織增生等[17-19]。

本實驗在前期HEO藥效學研究的基礎上[20]，通過急性炎癥模型對HEO的抗炎效果做進一步的藥理學研究。結果顯示，HEO處理可抑制急性炎癥小鼠耳腫脹。MDA是機體脂質過氧化反應中的代謝產物之一，其水平可反映機體的脂質過氧化程度，間接反映細胞的損傷情況[21]。本實驗發現，HEO可降低耳腫脹小鼠血清MDA的含量，因此推測HEO對小鼠耳腫脹的抑制作用可能與降低小鼠血清MDA的含量，抑制氧化應激有關。

A.模型對照組；B.阿司匹林組；C.HEO大劑量組；D.HEO小劑量組；與模型對照組比較，*1P<0.05。圖4 4組小鼠血清中PGE2含量比較A.model control group ;B.aspirin group ;C.high-dose HEO group ;D.low-dose HEO group ;Compared with model control group，*1P<0.05.Fig.4 Comparison of serum PGE2 content among four groups of

在炎癥部位，NO作用于血管平滑肌細胞，升高其cGMP水平，使血管舒張，通透性增高，以利于炎癥遞質和致痛物質到達作用部位，在炎癥反應中促進單核細胞向炎癥部位滲入[22]。PGE2是一種重要的促炎癥因子，是巨噬細胞產生的一種非蛋白、非多肽的脂肪酸代謝產物[23]。本實驗發現，HEO可降低耳腫脹度，同時也可降低小鼠血清NO和PGE2的含量，由此推斷HEO的抗炎作用可能與HEO降低組織內NO和PGE2的含量有關。

綜上所述，HEO對二甲苯致急性炎癥具有一定的抑制作用，其作用機制可能與降低NO和MDA含量，抑制炎癥因子PGE2表達有關，但其作用機制還需進一步探討。