橄欖苦苷對脾切除手術后老年大鼠認知功能障礙的影響

李文杰，陳楠

(鄭州人民醫院藥學部，鄭州 450003)

手術后認知功能障礙(post operative cognitive dysfunction ，POCD)是手術后易出現的中樞神經系統并發癥之一，常見于老年患者，可導致手術后恢復慢、住院時間延長、住院費用增加等，并嚴重影響患者手術后生活質量[1]。POCD機制尚不清楚，手術創傷所致腦組織氧化應激損傷在其發生和發展中起重要作用，因此拮抗氧化應激損傷是預防、減輕POCD的重要措施。橄欖苦苷(oleuropein)是來源于橄欖及橄欖油的酚類化合物成分之一。近年來，橄欖苦苷的藥理作用得到廣泛的研究，其具有抗腫瘤、保肝護腎、保護心腦血管、降低血糖、降血壓、抗炎、治療阿爾茨海默病等作用[2]。橄欖苦苷抗氧化作用顯著[3]，能夠有效緩解心肌氧化應激損傷[4]，但其是否對POCD有預防或減輕作用尚不清楚。因此，筆者擬建立大鼠脾切除手術后POCD模型，評價橄欖苦苷對手術后大鼠認知功能的作用，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1實驗主要試劑、設備及動物 橄欖苦苷(上海純優生物，批號170612-2，含量>98%)，溶于二甲亞砜(DMSO)中配制為10 mmol·L-1的原液，保存備用。二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號：20141216)；Rabbit Anti-β-Actin(Santa Cruz 公司，批號：sc-47778)；Nrf2 Rabbit mAb (CST公司，批號：D1Z9C)；Rabbit Anti-ERK1/2(p44/42 MAPK)(CST公司，批號：BY-04637)；核蛋白提取試劑盒(Phygene生物技術有限公司，批號：PH0324)；NBS超低溫冰箱(北京五洲東方科技有限公司術有限公司，型號：U410-86)；全波長酶標儀(美國DYNEX 公司，型號：Spectra Mr)；高速冷凍離心機(德國HERMLE 公司，型號：Z-323)。Morris水迷宮裝置[基爾頓生物科技(上海)有限公司](水池直徑150 cm，高50 cm，站臺直徑9.5 cm)。無特定病原體(SPF)級SD大鼠，雄性，18個月齡，體質量350～400 g，購自河南省實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(豫)2014-0003。動物房按照SPF級動物飼養標準保持恒溫、恒濕，晝夜交替時間12 h。動物不限飲食、飲水。

1.2動物分組和處理 大鼠分組應用隨機數字表法，分為假手術組、手術組和橄欖苦苷組(小、大劑量)，根據時間點細分為手術后1 d組、手術后3 d組、手術后5 d組，每組10只大鼠。小、大劑量橄欖苦苷組大鼠于手術后1，3 和 5 d分別灌胃給予橄欖苦苷20，50 mg· kg-1，假手術組、手術組大鼠手術后1，3和 5 d分別灌胃給予等量的溶媒。橄欖苦苷濃度選擇參照文獻[5]。

1.3模型建立 模型建立參照文獻[6]。手術組大鼠給予10%水合氯醛(劑量3.0 mL·kg-1)腹腔注射，達到理想麻醉效果(翻正反射消失)后，仰臥位于大鼠板上固定，術區備皮消毒，切口沿肋緣下橫切長2～3 cm，打開腹腔，探查到脾臟，離斷脾蒂，分離結扎脾血管，完整摘除脾臟，充分止血，用聚維酮碘消毒傷口，逐層關腹并縫合切口，切口處噴灑青霉素粉預防感染，用無菌敷料貼覆蓋，膠布固定。假手術組大鼠同樣方法麻醉，切皮后縫合，切口處噴灑青霉素粉。

1.4認知功能測試 采用經典Morris水迷宮，在術前5 d開始進行大鼠認知功能訓練，實驗方法如下：平臺放于水面下1 cm，放置于第Ⅰ象限。將大鼠隨機(頭朝池壁)從4個象限置入水中，記錄老年大鼠找到水下放置的平臺的時間，標記為潛伏期(s)，找到平臺后讓其在平臺上停留10 s。尋臺時間超過60 s者，則輕托大鼠到平臺，并在平臺上停留10 s，記錄潛伏期為60 s。接著撤去平臺，將大鼠由第Ⅰ象限對側輕放入水中，自由游泳60 s。記錄大鼠在目標象限(第Ⅰ象限)游泳的時間和進入此象限的次數。每只動物每天訓練4次，兩次訓練之間間隔30 min，連續訓練5 d。每次訓練結束后將大鼠擦干，放回籠內。訓練最后一天的4次訓練成績為術前平均成績。手術后第1，3，5 天按照上述訓練方法測試并記錄大鼠的潛伏期、穿臺次數及游泳時間。

1.5海馬組織胞漿蛋白和胞核蛋白的提取 每組大鼠測試結束后，立即處死，液氮上快速分離大鼠雙側腦區海馬組織，稱質量，剪碎，置于冰浴的研磨器皿中，根據比例加入適量4 ℃預冷磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution，PBS)充分勻漿至無肉眼可見組織，4 ℃、500 r·min-1(r=8 cm)離心5 min，收集細胞。加入漿蛋白抽提試劑(含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑)，高速渦旋15 s確保細胞沉淀分散完全，冰浴中靜置10 min，劇烈高速渦旋10 s，4 ℃、12 000 r·min-1(r=8 cm)離心10 min，取上清液，立即轉移入預冷的樣品管中置-20 ℃保存備用，此為胞漿蛋白。在離心沉淀物(細胞核)中加入核蛋白抽提試劑，高速渦旋15 s確保細胞沉淀分散完全，提取過程同漿蛋白。4 ℃、12 000 r·min-1(r=8 cm)離心10 min后取上清液即得核蛋白，-20 ℃保存備用。實驗時取出樣品，采用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。

1.6酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測大鼠海馬組織內MDA含量和SOD水平 取胞漿蛋白檢測SOD及MDA水平。SOD活性應用氮藍四唑(NBT)法檢測，取MDA檢測工作液，加入組織樣品中，混勻，100 ℃水浴20 min，立即放置水浴中15 min，1000 r·min-1(r=8 cm)離心10 min，取上清液備用。取試劑盒中配備的96孔板中，加入上清液200 μL，利用酶標儀在波長532 nm處測定A值，根據說明書計算組織中SOD活性(U·mg-1)。

1.7Western blotting 實驗檢測大鼠海馬組織內蛋白表達水平 取“1.5”項中樣品，加入等量的loading buffer混合，置于100 ℃沸水加熱變性后上樣，制備10% SDS-PAGE凝膠，電泳法分離蛋白，采用濕轉法轉移至聚偏二氟乙烯膜，室溫條件封閉2 h，TBST洗滌3次，每次10 min。加入封閉液稀釋的一抗(p-ERK1/2 、Nrf2)4 ℃孵育24 h。TBST洗滌3次，每次10 min，二抗[1：1000，辣根過氧化物酶(HRP)標記]37 ℃孵育2 h，TBST漂洗3次，電化學發光法顯色，然后利用Image Pro Plus 6.0版軟件分析條帶的積分吸光度(A)。

2 結果

2.1Morris水迷宮實驗結果 手術前各組大鼠潛伏期、穿臺次數和游泳時間差異無統計學意義。手術后1 d，與假手術組比較，手術組大鼠潛伏期延長(F=6.27，P<0.05)，穿臺次數及游泳時間均差異無統計學意義；與手術組比較，橄欖苦苷組大鼠潛伏期、穿臺次數和游泳時間差異無統計學意義。手術后3，5 d，手術組大鼠較假手術組潛伏期延長、穿臺次數及游泳時間減少；橄欖苦苷組大鼠較手術組潛伏期縮短(F=7.51，P<0.05；F=13.50，P<0.01)，穿臺次數增加(F=23.95，P<0.01；F=34.58，P<0.01)，游泳時間增加(F=19.82，P<0.01；F=13.78，P<0.01)。結果見圖1～3。

與假手術組比較，*1P<0.05，*2P<0.01；與手術組比較，*3P<0.05，*4P<0.01。圖1 4組大鼠手術前后的潛伏期比較Compared with sham operation group,*1P<0.05，*2P<0.01;compared with surgery group，*3P<0.05，*4P<0.01.Fig.1 Comparison of incubation period among four groups of rats before and after

與假手術組比較，*1P<0.01；與手術組比較，*2P<0.05，*3P<0.01。圖2 4組大鼠手術前后的穿臺次數比較Compared with sham operation group,*1P<0.01;Compared with surgery group，*2P<0.05，*3P<0.01.Fig.2 Comparison of the number of platform-site crossovers among four groups of rats before and after

與假手術組比較，*1P<0.01；與手術組比較，*2P<0.05，*3P<0.01。圖3 4組大鼠手術前后的游泳時間比較Compared with sham operation group,*1P<0.01;compared with surgery group，*2P<0.05，*3P<0.01.Fig.3 Comparison of swimming duration among four groups of rats before and after

2.2大鼠手術后SOD活性及MDA含量 結果見表1。

表1 4組大鼠手術后SOD活性及MDA含量比較Tab.1 Comparison of SOD activity and MDA content among four groups of rats after operation

與假手術組同時間點比較，*1P<0.01，*2P<0.05；與手術組同時間點比較，*3P<0.05，*4P<0.01。
Compared with sham operation group at same time point，*1P<0.01，*2P<0.01；Compared with surgery group at same time point，*3P<0.05，*4P<0.01.

與假手術組比較，手術組大鼠海馬組織內MDA含量增加，SOD含量減少，表明手術后老年大鼠腦組織內產生了氧化應激損傷。與手術組比較，橄欖苦苷組大鼠海馬組織內MDA含量減少(F=22.66，P<0.01；F=35.26，P<0.01；F=26.32，P<0.01)，SOD增加(F=10.52，P<0.05；F=8.35，P<0.05；F=23.64，P<0.01)，提示橄欖苦苷可能發揮抗氧化作用，減少應激損傷。

2.3大鼠海馬組織內蛋白表達的比較 與假手術組比較，手術組大鼠海馬組織內p-ERK1/2、n-Nrf2、總Nrf2表達降低。與手術組比較，手術后橄欖苦苷組大鼠海馬組織p-ERK1/2表達增加(F=5.83，P<0.05；F=30.96，P<0.01；F=26.32，P<0.01)，n-Nrf2表達增加(F=25.62，P<0.01；F=39.20，P<0.01；F=23.44，P<0.01)，總Nrf2表達增加(F=14.75，P<0.01；F=41.26，P<0.01；F=16.95，P<0.01)。結果見圖4。

3 討論

POCD的風險因素較多，脾切除手術后會導致大鼠出現短暫的認知功能障礙[7]，故筆者選擇脾切除手術建立手術后POCD模型，并采用Morris水迷宮方法測試老齡大鼠手術后的認知功能。為排除麻醉方式/藥物對POCD的影響，本研究采用統一的麻醉方案。

脾切除手術后機體應激導致腦組織內皮細胞受損，促進炎癥反應，同時促進β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的合成，釋放氧自由基并在神經元聚集，損傷腦組織，導致認知功能缺陷[8-9]。本研究發現，脾切除手術前各組大鼠潛伏期、穿臺次數和游泳時間均差異無統計學意義，即術前實驗大鼠認知功能沒有差異。手術后大鼠潛伏期延長，穿臺次數、游泳時間顯著減少，提示手術后大鼠的認知功能受到損傷。給予橄欖苦苷腹腔注射后，手術后大鼠潛伏期縮短，穿臺次數及游泳時間增加，提示橄欖苦苷在一定程度上改善了脾切除手術后老年大鼠的認知功能障礙。

A.假手術組；B.手術組；C.橄欖苦苷小劑量組；D.橄欖苦苷大劑量組；與手術組比較，*1P<0.05，*2P<0.01；與假手術組比較，*3P<0.01。圖4 4組大鼠手術后海馬組織p-ERK1/2、n-Nrf2、總Nrf2的表達A.sham operation group；B.surgery group；C.low-dose oleuropein group；D.high-dose oleuropein group；Compared with surgery group，*1P<0.05，*2P<0.01;compared with sham operation group,*3P<0.01.Fig.4 Comparison of the expression of p-ERK1/2,n-Nrf2 and total Nrf2 in hippocampus among four groups of rats after

在正常生理情況下，機體自由基的生成和清除之間保持動態平衡，在手術創傷、炎癥反應等過程中，尤其對于高齡、合并基礎疾病、大手術患者，由于機體清除自由基能力減弱，過多的自由基會導致富含脂質的腦組織損傷。自由基可使腦組織脂質過氧化，產生MDA，其在體內含量的多少反映機體過氧化程度的高低。SOD 是一種具有抗氧化作用的酶，其水平的高低反映了機體的抗氧化能力。本研究觀察到在脾切除手術后大鼠海馬組織內MDA含量顯著增加，SOD含量顯著減少，此時大鼠潛伏期延長，穿臺次數及游泳時間減少，表明手術后由于老年大鼠腦組織內產生了氧化應激損傷，從而影響了大鼠的認知功能。橄欖苦苷組大鼠海馬組織內MDA含量減少，SOD增加，潛伏期縮短，穿臺次數及游泳時間增加，表明橄欖苦苷發揮了抗氧化作用，改善了大鼠的認知功能。

Nrf2是抗氧化系統重要的調控因子，生理狀態下，結合狀態的Nrf2位于細胞質中。在氧化應激狀態下Nrf2激活并解離，進入細胞核，與抗氧化反應元件(ARE)位點相結合，調控多種抗氧化應激蛋白酶的合成。Nrf2-ARE通路可調節細胞內氧化還原平衡[10-11]，屬于機體自身內源性抗氧化酶防御體系。文獻表明三七總皂苷可能通過上調Nrf2/ARE 信號通路，激活內源性抗氧化酶系統如血紅素氧合酶-1(HO-1)、SOD、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等，從而抑制Aβ25 -35誘導PC12 細胞氧化應激和凋亡[12]。多種信號通路參與對Nrf2轉錄活性的調節，如作為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族中的一個重要的亞族，ERK通過磷酸Nrf2的方式使其激活解離，發生核轉位，誘導下游抗氧化基因表達，發揮細胞保護作用[13-14]。

本研究發現，手術后1 d，手術組的大鼠海馬組織內p-ERK1/2、n-Nrf2及總Nrf2水平無變化，手術后3，5 d其表達均顯著降低。這可能因為老年大鼠免疫系統調節能力下降，早期適度的手術后應激可促進Nrf2的表達，發揮內源性抗氧化作用，而過度的氧化應激會導致腦組織產生大量的氧自由基，超過了脆弱的海馬組織的代償能力，造成Nrf2表達的下降和核移位減少[15]。Morris水迷宮實驗觀察到手術后第1天，大鼠的穿臺次數及游泳時間與假手術組比較沒有變化，也推測可能是手術后大鼠體內內源性抗氧化系統發揮了一定的抗氧化作用。有研究顯示在創傷性腦損傷大鼠腦組織內Nrf2-ARE參與了內源性的防御機制，其表達水平在創傷24 h到達高峰，其后逐漸下降[16]。手術后橄欖苦苷組大鼠海馬組織p-ERK1/2表達增加，細胞核內 Nrf2及總的Nrf2表達增加，提示橄欖苦苷能夠顯著上調大鼠海馬組織中p-ERK1/2的蛋白表達水平，促進Nrf2的細胞核轉位，減少脂質過氧化產物的生成，拮抗手術造成的氧化應激損傷，改善老年大鼠手術后認知功能。

總之，本研究初步表明，橄欖苦苷能夠明顯改善脾切除手術后老年大鼠認知功能障礙，其機制可能與其抑制激活Nrf2/ERK通路有關。