頂空毛細管氣相色譜-熱導檢測器法測定抗菌藥物中的水分*

符傳武，洪薇，鐘文俊，覃華亮，覃子龍，李俊霖，劉永逸

(柳州市食品藥品檢驗所，柳州 545006)

水分會影響抗菌藥物的穩定，造成藥效降低，甚至會使抗菌藥物降解，產生對人體有害的物質[1]，因此，抗菌藥物中的水分是藥品質量控制中一項特別重要的指標。目前國內公開報道的抗菌藥物水分的測定有卡爾費休氏法[2-10]、微波加熱法[11]、減壓干燥法[12]和近紅外光譜法[13-17]，其中報道最多的是采用卡爾費休法。

卡爾費休法是Karl Fischer在1935年提出的測定水分的分析方法[18]，其原理是利用碘將二氧化硫氧化為三氧化硫時，需要一定量的水參與反應，由消耗碘的量計算出水分的含量，它屬于水分測定的經典方法，已被列為許多物質中水分測定的標準方法[19]，在《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0832收載有此法，用于測定藥品中水分的含量。其具有對水選擇性強、準確和精密度高、樣品用量少及樣品制備簡單等優點，但該法所使用的試液及試劑有較高的毒性，對環境及檢測人員的身體健康構成了較大的威脅，因此建立一種對人體危害小又能批量快速測定抗菌藥物中水分的檢測方法非常有必要。

筆者目前還未見有關采用頂空毛細管氣相色譜-熱導檢測器法測定抗菌藥物中水分的文獻報道。筆者采用對人員和環境較為友好的乙醇提取試劑，所建立的氣相色譜法能快速、準確地測定抗菌藥物中的水分。

1 儀器與試藥

1.1儀器 GC-2010 Plus氣相色譜儀、熱導檢測器(TCD，日本島津公司)；XS205DU電子分析天平(瑞士Mettler 公司，感量：0.01 mg)。

1.2試藥 阿莫西林膠囊(華北制藥股份有限公司，簡稱HB，哈藥集團制藥總廠，簡稱HY，瑞陽制藥有限公司，簡稱RY，吉林萬通藥業集團梅河藥業股份有限公司，簡稱WT，山東魯抗醫藥股份有限公司，簡稱LK，先聲藥業有限公司，簡稱XS，四川峨眉山藥業有限公司，簡稱EMS，成都錦華藥業有限責任公司，簡稱JH，批號分別為F6102316，A1503168，15051702，20161015，1610026，02-161108，20170301，170304)；頭孢氨芐膠囊(山東魯抗醫藥股份有限公司，批號：160701)；頭孢克肟膠囊(天津華津制藥有限公司，簡稱HJ，批號：6E262C)；頭孢克肟片(白云山制藥總廠，簡稱BYS，山東羅欣藥業集團股份有限公司，簡稱LX，湖南方盛制藥股份有限公司，簡稱FS，山東羅欣藥業集團股份有限公司，浙江巨泰藥業有限公司，簡稱JT，山東魯抗醫藥股份有限公司，批號分別為20170005，617042312，170301，617102202，T01170601，170203)；頭孢克洛片(石藥集團歐意藥業有限公司，簡稱OY，白云山制藥總廠，批號分別為021170601，20170003)；頭孢丙烯片(山東羅欣藥業集團股份有限公司，批號：617052243X)；頭孢拉定片(湖南科倫制藥有限公司，簡稱KL，批號：H150604)；乙醇(含量99.9%，色譜純)；甲醇(北京百靈威科技有限公司，含量99.8%，色譜純)；水為Ⅰ級純化水。

2 方法與結果

2.1色譜條件 采用頂空毛細管氣相色譜-熱導檢測器法進行測定，使用Agilent HP-PLOT/Q毛細管色譜柱(30 m×0.530 mm，40 μm)；載氣為高純氦氣，流量3 mL·min-1；進樣量250 μL，分流比20：1，進樣口溫度為200 ℃；頂空進樣，采用氣密針模式的頂空進樣(氣密針溫度為95 ℃)，頂空瓶的平衡溫度為85 ℃，平衡時間為10 min；柱溫箱：采取程序升溫，初始溫度150 ℃，保持6 min，以60 ℃·min-1的速率升到250 ℃，保持5 min；熱導檢測器溫度為250 ℃，電流為70 mA。

2.2溶液的制備

2.2.1內標提取溶液 取甲醇4 mL，用乙醇定容至1000 mL，作為內標提取溶液。

2.2.2溶劑空白溶液 精密加入內標提取溶液3 mL，置20 mL頂空進樣瓶中，密封，作為溶劑空白溶液。

2.2.3對照品溶液 精密稱取水15 mg，置20 mL頂空進樣瓶中，精密加入內標提取溶液3 mL，密封，作為對照品溶液。

2.2.4供試品溶液 精密稱取樣品0.1 g，置20 mL頂空進樣瓶中，精密加入內標提取溶液3 mL，密封，作為供試品溶液。

2.3系統適用性實驗及專屬性考察 取一個20 mL頂空進樣瓶密封為A瓶；取3 mL水置20 mL頂空進樣瓶中密封，為B瓶；取3 mL甲醇，置20 mL的頂空進樣瓶中密封為C瓶。取上述的溶劑空白溶液、對照品溶液及供試品溶液作為系統適用性考察供試品。分別精密吸取250 μL注入氣相色譜儀，按“2.1”項下的色譜條件測定，記錄色譜圖。理論板數以水和甲醇峰計，均不低于20 000，各峰分離度均大于1.5。水保留時間約為2.1 min，甲醇保留時間約為2.7 min(圖1)，由于溶劑空白中含有水峰，故本次測定采取扣除本底的方法以消除對測定結果的影響。

2.4線性關系考察 分別精密稱取水適量，置20 mL頂空進樣瓶中，精密加入內標提取溶液3 mL，密封，配制濃度為1.717，3.333，5.000，8.333，16.667 mg·mL-1的系列對照品溶液。分別精密量取250 μL，注入氣相色譜儀，記錄圖譜，以水的色譜峰(扣除溶劑中水的峰面積)與內標甲醇峰比值(Y=A水/A內)，分別對其濃度(C，mg·mL-1)進行線性回歸。結果回歸方程和相關系數分別為：Y=0.201 2C+0.006 0，r=0.999 8，表明水峰在含量為1.717～16.667 mg·mL-1范圍內線性良好。

2.5精密度實驗 取“2.2.2”項的溶劑空白溶液6份，按“2.1”項色譜條件，每份進樣1次，結果水峰與甲醇峰比值(K=A水/A內)的RSD為 4.4%，說明儀器精密度良好。

2.6重復性實驗 取同一批(批號：02-161108)樣品6份，精密稱定，按 “2.2.4”項制備供試品溶液，按“2.1”項的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，計算水的平均含量為12.55%，RSD 為 4.7%。結果表明該方法重復性較好。

2.7加樣回收率實驗 精密稱取同一批(批號：02-161108)已知水分含量的阿莫西林膠囊樣品9份，每份約0.05 g，加入水適量，照“2.2.4”項供試品溶液配制的方法配制低、中、高3種濃度的溶液，并按上述色譜條件下進行測定，計算回收率及RSD，結果平均回收率為92.76%～103.55%，RSD均在5.0%范圍內，見表1。

2.8穩定性實驗 取同一批(批號：02-161108)樣品4份，精密稱定，按 “2.2.4”項制備供試品溶液，在室溫下放置0，3，6，12 h測定，記錄主峰面積，結果表明，樣品中水的含量無明顯變化，其RSD為5.7%。

1.空氣；2.水；3.甲醇；4.乙醇。圖1 空氣(A)、水(B)、甲醇(C)、溶劑空白(D)、對照品溶液(E)、供試品溶液(F)色譜圖 1.air;2.water;3.methanol;4.ethanol.Fig.1 GC chromatogram of air (A),water (B),methanol (C),blank solvent (D),reference substances (E)and sample solution (F)

表1 阿莫西林加樣回收率測定結果Tab.1 Results of recovery test of amoxicillin n=3

2.9樣品測定 精密稱取20個抗菌藥物樣品，照“2.2.4”項的方法制備溶液；按“2.1”項的色譜條件，記錄色譜圖。按內標法以峰面積計算水的含量，同時用法定檢測方法——費休法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0832第一法)對其測定，結果用費休法和氣相法測定結果無顯著差異，且均符合標準的規定，見表2。

3 討論

3.1頂空條件的考察 本次頂空條件考察使用批號為02-161108的樣品，為了便于考察方法的可靠性，本研究先用費休法測定其水分的含量(12.7%)，再將頂空條件的考察結果與其進行比較，最終確定與費休法測定結果無顯著差異的頂空條件。

取樣量及提取溶劑考察：在樣品瓶平衡溫度為85 ℃，平衡時間為30 min以下，考察了取樣量為0.05，0.1，0.25，0.5，1.0 g，提取溶劑加入量為3，5，10 mL時抗菌藥物中水的含量，結果顯示，當取樣量為0.05或0.1 g，提取溶劑加入量為3，5，10 mL時，測定結果與費休法測定結果無顯著差異。

取樣量及樣品平衡時間的考察：在平衡溫度為85 ℃，提取溶劑加入量為3 mL時，考察了取樣量為0.05，0.1，0.25，0.5，1.0 g，頂空進樣瓶平衡時間為5，10，20，30 min，結果顯示，當取樣量為0.05或0.1 g，頂空進樣瓶平衡時間為10，20，30 min，本法測定結果與費休法測定結果無顯著差異。

樣品瓶平衡溫度的考察：當空白溶劑溶液、對照品溶液、供試品溶液精密加入內標提取溶液3 mL，取樣量為0.05，0.1 g，平衡時間為10 min時，樣品瓶平衡溫度為85 ℃，其測定結果與費休法測定結果無顯著差異；當樣品瓶平衡溫度為75或65 ℃時，其測定結果比費休法測定結果偏低。

3.2測定方法的選擇 文獻報道測定抗菌藥物中的水分主要有近紅外法[13-17]、干燥失重法與費休法[7]。近紅外法測定水分快速、簡便，但前期必須花大量的精力來建立相關的定量模塊；干燥失重法設備便宜，操作簡單，但由于部分抗菌藥物含有揮發溶劑，不能很準確反映抗菌藥物真實水分的含量；費休法專屬性強，準確度高，但其所使用的試劑毒性較大，不符合當今綠色檢測的理念。筆者參考有關文獻[20-22]，使用頂空毛細管氣相色譜-熱導檢測器，測定抗菌藥物中的水分，所使用的試劑較為環保，試劑使用量少，前處理操作簡單，測定結果準確可靠。

表2 樣品含量測定結果Tab.2 Results of content determination on the samples n=3

3.3含量計算方法的選擇 為了消除樣品前處理及進樣體積誤差對測定結果的影響及后期計算的便利，本次實驗采用內標一點法進行定量分析，經比較，內標一點法計算的結果有較好的重復性。由于提取溶劑中含有部分水，計算時必須把這部分的水量扣除，具體計算公式如下：

(1)內標提取溶液校正因子計算公式：K=A水1/A甲醇1

(2)對照品校正因子計算公式：F=A甲醇2×C水2/[(A水2-K×A甲醇2)×C甲醇2]

(3)樣品含水量計算公式：水%=[F×(A水3-K×A甲醇3)×C甲醇3×N]/A甲醇3×W×1000×100%

K為內標提取溶液校正因子；A水1為內標提取溶液水的峰面積；A甲醇1為內標提取溶液甲醇的峰面積；F為對照品溶液校正因子；A水2為對照品溶液水的峰面積；A甲醇2為對照品溶液甲醇的峰面積；C水2為對照品溶液水的含量，單位為mg·mL-1；C甲醇2為對照品溶液甲醇的含量，單位為%；A水3為供試品溶液中水的峰面積；A甲醇3為供試品溶液中甲醇的峰面積；C甲醇3為供試品溶液中甲醇的濃度，單位為%；N為稀釋倍數；W為供試品取樣量，單位為g；1000為單位換算系數。

3.4色譜柱的選擇及程序升溫條件的優化 選取3根不同型號的色譜柱：HP-PLOT/Q(30 m×0.530 mm，40 μm)，150 ℃保持6 min，以60 ℃·min-1升溫至250 ℃，保持5 min；DB-624(30 m×0.530 mm，3 μm)，60 ℃保持2 min，以10 ℃·min-1升溫至140 ℃，保持1 min；DB-FFAP(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，60 ℃保持6 min，以60 ℃·min-1升溫至200 ℃，保持2 min。結果3根色譜柱各峰分離度均大于1.5，理論板數以水和甲醇峰計，均在20 000以上。

3.5進樣方式選擇 由于液體進樣方式會把樣品本身及樣品中含有的不揮發性組分注入氣相色譜中，這不僅會污染進樣針，還會污染進樣口和色譜柱，故本研究采用較為簡便、干凈、快速，且不需要使用大量有機溶劑的頂空進樣方式進樣。

3.6濕度對實驗的影響 研究表明，環境的濕度對測定結果重現性有一定的影響[22]，當環境濕度較大時，應該控制實驗室的濕度。前處理時應該充分考慮到這一因素，盡量縮短其與空氣接觸的時間及所用的容器必須干燥。

3.7其他問題 利用本法測定多批注射用頭孢曲松鈉水分時發現，其測定結果與費休法測定結果有較大差別(費休法測定結果約為本法測定結果的1.7倍)，但與烘干法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0832第二法)測定結果又較為接近，造成此現象的原因，筆者認為是由于頭孢曲松鈉本身或者注射用頭孢曲松鈉中所含有的輔料(已有文獻報道[1]，輔料無水碳酸鈉對費休法測定水分有干擾，致使測定結果偏高)能與碘反應，致使卡爾費休法試劑消耗增加，從而使測定結果偏高，故《中華人民共和國藥典》2015年版二部使用費休法測定注射用頭孢曲松鈉水分的合理性及準確性有待于進一步探討。

筆者曾考察多個廠家的無水乙醇和含量為99.9%的色譜乙醇，其溶劑均含有一定量的水，在色譜圖上有較為明顯的色譜峰，故本法無需考察方法的檢出限，但為了減少本底的干擾，對照品溶液與供試品溶液的配制必須用同一瓶新配的內標提取溶液，按“3.3”項的計算方法扣除本底的干擾。從“2.9”項樣品測定結果可以看出，本計算方法能有效地消除本底水分的干擾。

由于溶劑中含有水分，對含水量較低樣品的測定誤差可能會比較大，本課題組下一步將繼續研究消除溶劑中水分的相關技術，以彌補本法的不足。