解郁育胞方對慢性應激大鼠著床窗期外周血Th17/Treg的影響*

耿會轉，滕婧，劉凱，王敏，張平，盧文婷，周順長，黎烈榮

(1.湖北中醫藥大學第一臨床學院，武漢 430061；2.湖北省中醫院婦產科，武漢 430061；3.華中科技大學實驗動物中心，武漢 430030)

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級未孕SD雌性大鼠，8周齡，體質量(200±10)g，連續1周做陰道脫落細胞涂片觀察，選擇有正常動情周期者40只納入實驗；SPF級雄性健康性成熟SD大鼠20只，體質量(250±10)g，均由湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(鄂)2008-0005，動物合格證號：42000600004150。所有大鼠經無菌程序轉入華中科技大學實驗動物中心SPF級屏障系統動物實驗室，實驗動物使用許可證號：SYXK(鄂)2010-0057。動物實驗環境維持相對濕度40%～60%，溫度20～24 ℃，噪聲<60 dB，自由飲用無菌水，進食滅菌全價營養顆粒飼料(湖北萬千佳興實驗動物有限公司提供)。

1.2藥物 解郁育胞方藥物組成：白芍10 g(批號為610101)，當歸10 g(批號為802101)，白術10 g(批號為710112)，茯苓10 g(批號為1402007)，熟地15 g(批號為609102)，山藥 15 g(批號為711205)，酒萸肉10 g(批號為801109)，醋香附10 g(批號為701112)，玫瑰花10 g(批號為609015)。所有藥物均為精選中藥，執行標準：《中華人民共和國藥典》2015年版，由湖北辰美有限公司提供。處方藥材炮制合格后，經湖北省中醫院中藥制劑室按水提法制成200 mL，藥物濃度0.5 g·mL-1，放入4 ℃冰箱保存。醋酸潑尼松片(天津力生制藥公司，批號：1701205)每片5 mg，用200 mL雙蒸水配置使用，藥物濃度0.025 mg·mL-1。

1.3試劑 RORγ免疫組化試劑盒(Bioss公司，批號：Bs-3863R)，Foxp3免疫組化試劑盒(武漢三鷹生物技術有限公司，批號：22228-1-AP)，無水乙醇(國藥集團，批號：10009218)，APC標記抗鼠白細胞介素(IL)-17(IL-17-APC)流式抗體(北京博奧森生物技術有限公司，批號：22016-1-022)，APC標記鼠抗Foxp3(北京博奧森生物技術有限公司，批號：22013-1-102)，二甲苯(國藥集團，批號：10023418)，蘇木精(Sigma公司，批號：H9627)，中性樹膠(國藥集團，批號：10004160)等。

1.4儀器 流式細胞儀 (美國 Beckman Coulter)，病理切片機(德國Leica RM 2016輪轉式切片機)，切片刀(日本羽毛R35一次性刀片)，載玻片及蓋玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司)顯微鏡(日本 奧林巴斯BX53型生物顯微鏡檢)。

1.5方法

1.5.1建立模型 采用ENNIS等[9]所述方法制作慢性應激大鼠模型。接受應激處理的大鼠置于獨立房間，連續接受14 d的不同的應激原刺激，包括行動受限(2 h)、噪音(75 dB，1 h)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、夾尾(1 min，每天3次)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、電擊足底(電壓50 mV，每隔50 s刺激1次，每次持續10 s，共30次)。每日抓鬮隨機選擇2種刺激。刺激14 d后以出現倦怠懶動、進食興趣降低及修飾行為(抓癢、抬舉、舔足等)減少等明顯生物學行為，提示造模成功。

1.5.2給藥方法 參照《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比率表》(見陳奇主編《中藥藥理實驗方法》1994年版)來折算大鼠每日用藥量。按照臨床有效劑量計算出大鼠每日解郁育胞方用藥9 g·kg-1，轉化為混懸藥液18 mL·kg-1，即給藥容積18 mL·kg-1。按照體質量分層隨機法將大鼠4組：正常對照組，應激組，應激+潑尼松組，應激+解郁育胞方組，每組10只。除正常對照組外，其余3組大鼠建立慢性應激模型。于刺激第15天開始，應激+潑尼松組每天9：00給予潑尼松溶液灌胃，給藥劑量為0.45 mg·kg-1，給藥容積為18 mL·kg-1；正常對照組、應激組灌服等體積純化水(18 mL·kg-1)；應激+解郁育胞方組給予解郁育胞方溶液劑量為9 g·kg-1，給藥容積為18 mL·kg-1。4組大鼠分別于第28天16：00 按照雌：雄=2：1合籠，經陰道涂片確認妊娠后第4天停藥，當日16：00 處死大鼠，釆用流式細胞技術檢測著床窗外周血Thl7、Treg細胞比例及比值；同時采用免疫組化技術檢測著床窗子宮內膜 RORγt、Foxp3的表達。

②免疫組織化學(SP法)檢測各組大鼠著床窗子宮內膜 RORγt、Foxp3的表達：取血結束后處死大鼠，剖取并分離子宮，其中一側置10%多聚甲醛中固定待檢，子宮組織常規石蠟包埋、3 μm厚切片，常規脫蠟、水化，EDTA 組織抗原修復后，將配置好的修復液(0.01 mmol·L-1枸櫞酸緩沖液，pH值6.0)置于燒杯中高火煮沸，再將脫蠟水化后的組織切片置于燒杯中的耐高溫塑料切片架上，液面要浸過切片組織，修復時間10～15 min，用吸水紙擦干玻片組織周圍的液體，用油性筆在組織周圍畫圈，然后滴加稀釋好的一抗(FOXP3抗大鼠多克隆抗體1：10)，加完一抗后于4 ℃濕盒中孵育過夜(15 h)。PBS沖洗切片3次，每次3 min，吸水紙擦干切片后滴加HRP標記的山羊抗兔/小鼠二抗，室溫或37 ℃孵育20 min。加顯色劑：PBS沖洗切片4次，每次3 min，甩去PBS液，吸水紙擦干切片，每張切片滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，陽性信號為棕黃色或棕褐色，時間要控制好，切勿顯色過深，當覺得可以時用自來水沖洗切片終止顯色。再經過復染、脫水、封片，奧林巴斯BX53型生物顯微鏡檢拍照，采集圖像，每張切片選取3張400倍照片做吸光度分析，IPP6.0版軟件對免疫組化照片進行吸光度分析。

2 結果

2.1各組大鼠子宮內膜Foxp3和RORγt的檢測結果 見表1及圖1。可知，Foxp3主要表達于子宮內膜腺上皮細胞的胞漿和部分基質血管內皮細胞的胞漿，部分間質細胞有弱著色，各組表達強弱不一。4組平均吸光度值分別為：0.028±0.005，0.014±0.007，0.056±0.008，0.025±0.007。與正常對照組比較，應激組Foxp3的表達顯著降低(P<0.05)，說明慢性應激對大鼠著床期子宮內膜Foxp3表達有抑制作用。應激+潑尼松組Foxp3的表達與其余3組比較，均差異有統計學意義(P<0.05)，說明潑尼松在抑制免疫方面有較好的作用。應激+解郁育胞方組與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

各組大鼠子宮內膜RORγt的表達見圖2及表1。可知，RORγt表達主要位于子宮內膜腺上皮細胞的胞漿，各組表達強弱不一。4組平均吸光度值分別為：0.026±0.007，0.032±0.005，0.028±0.005，0.029±0.003。與正常對照組比較，應激組著床窗期子宮內膜RORγt表達顯著增加(P<0.05)，說明慢性應激對大鼠的子宮RORγt表達有增強作用。應激+解郁育胞方組與正常對照組、應激+潑尼松組比較均沒有明顯差異(P>0.05)。

表1 4組大鼠子宮內膜Foxp3、RORγt檢測結果Tab.1 Determination results of Foxp3 and RORγt in the endometrium of four groups of rats

與正常對照組比較，*1P<0.05；與應激組比較，*2P<0.05。
Compared with normal control group，*1P<0.05;compared with stress group，*2P<0.05.

圖1 4組大鼠子宮內膜Foxp3的表達Fig.1 Foxp3 expression in the endometrium of four groups of rats

圖2 4組大鼠子宮內膜RORγt的表達Fig.2 RORγt expression in the endometrium of four groups of rats

2.2外周血Th17、Treg亞群比例及比值比較 見表2。正常對照組與應激組Th17亞群細胞比例有明顯差異(P<0.05)；與應激組比較，其余3組Th17亞群細胞比例均明顯降低(P<0.05)，應激+解郁育胞方組與正常對照組、應激+潑尼松組Th17亞群細胞比例無明顯差異(P>0.05)。Treg亞群細胞比例比較：正常對照組與應激組有明顯差異(P<0.05)；與應激組比較，其余3組Treg亞群亞群細胞比例均明顯升高(P<0.05)，應激+解郁育胞方組與正常對照組、應激+潑尼松組Treg亞群細胞比例無明顯差異(P>0.05)。Th17/Treg比值方面：正常對照組與應激+解郁育胞方組無明顯差異(P>0.05)；與應激組比較，其余3組Th17/Treg比值均有明顯差異(P<0.05)；與應激+潑尼松組比較，正常對照組、應激+解郁育胞方組Th17/Treg比值均有明顯差異(P<0.05)。

表2 4組大鼠 Th17、Treg亞群比例及比值比較Tab.2 Comparison of the proportion and ratio of Th17 and Treg subgroups among four groups of rats

與正常對照組比較，*1P<0.05；與應激組比較，*2P<0.05。
Compared with normal control group，*1P<0.05;compared with stress group，*2P<0.05.

2.3相關性分析 Th17/Treg比值與RORγt表達呈正相關(r=0.608，P<0.05)，Th17/Treg比值和Foxp3的表達呈負相關(r=-0.389，P<0.05)。

3 討論

醋酸潑尼松具有抗炎、抗過敏、免疫抑制作用，可減輕和防止組織對炎癥的反應，從而減輕炎癥的表現；抑制炎癥細胞，包括巨噬細胞和白細胞在炎癥部位的集聚，并抑制吞噬作用、溶酶體酶的釋放以及炎癥化學中介物的合成和釋放，防止和減輕組織對炎癥的反應，減輕炎癥表現；防止或抑制細胞介導的免疫反應及延遲性的變態反應，減少T淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞的數目，降低免疫球蛋白與細胞表面受體的結合能力，并抑制IL的合成與釋放，從而降低T淋巴細胞向淋巴母細胞轉化，并減輕原發免疫反應的擴展。臨床上常用醋酸潑尼松減輕母胎界面的炎癥反應，在本研究中用作陽性對照藥物。但妊娠期婦女使用潑尼松可增加胎盤功能不全、新生兒體質量減少或死胎的發生率，動物實驗有致畸作用，應權衡利弊使用。

對于情志活動異常的心理應激反應所引起的神經、內分泌、免疫功能失調，調肝是治療的基礎方法。中醫各臟均在心理應激調節中起著作用，但核心在于肝臟。心理應激的物質基礎是NIM網絡，而中醫肝的疏泄是維持促進全身氣血運行，調適臟腑對應激的反應，存在著一定的NIM網絡調節機制。解郁育胞方是黎烈榮教授以《傅青主女科·嫉妒不孕》開郁種玉湯及《太平惠民和劑局方》逍遙散化裁，是課題組經臨床和實驗研究多年的驗方，由當歸、白芍、香附、玫瑰花、白術、茯苓等組成，稟疏肝養肝、健脾益精為大法。香附、玫瑰花專于理氣，疏肝解郁為君藥。香附氣平而不寒，專屬開郁散氣、順肝之性，助肝之用。凡情志抑郁，肝失疏泄條達，氣不能正常入于三焦，以致氣結為病者，香附為必用品。玫瑰花柔肝醒脾，流氣和血，和而不猛，宣通郁滯，而絕無辛溫剛燥之弊，是柔肝和血之佳品。當歸、白芍為肝經要藥，當歸補血，其氣輕而辛，為血中之氣藥，入肝經而行血，疏達肝之氣血；白芍斂肝柔肝，補斂肝之陰血，如是一補一行，一動一靜，既養肝體又助肝用。君臣相伍，疏肝養肝，改善由于高強度、長時間的應激造成的機體內環境紊亂及免疫失調。肝郁不能疏泄水谷且又克脾土，使脾運化水谷功能失調，水濕不能運化從而出現“滲瀉中滿之證”，導致“腰臍之氣不利”，任帶失調，胎孕不受。白術苦甘溫，歸脾胃經，茯苓健脾滲濕，二者相伍補土實脾，通達任帶。熟地、山藥、山萸肉取六味地黃丸中三補，益腎填精，共為佐使。腎主生殖，脾為氣血運化之源，脾腎兩虛，與現代醫學免疫紊亂相似。諸藥配合，解肝郁，養肝血，健脾氣，填腎精，疏中有養，補中寓通，行氣而不傷正，養精而不滯血，使氣血調和，任通沖盛，胞宮受物而易于孕育。

本研究發現，慢性應激大鼠著床期外周血Th17/Treg升高，子宮內膜表達Foxp3降低，RORγt水平升高，采用解郁育胞方肝郁后Th17/Treg下降至接近正常水平，著床窗期子宮內膜Foxp3表達明顯升高，RORγt表達下降。解郁育胞方提高慢性應激大鼠子宮內膜容受性的可能機制為通過疏肝健脾益腎，使肝腎開合有度，藏瀉有衡，任通沖盛，胞宮得養；脾氣健運，氣血生化有源。肝之疏泄，脾腎調補，共同作用于胞宮，調節機體免疫系統，降低應激對機體的損傷，增加機體抗應激能力，使Th17/Treg失衡得到糾正，共同維護母胎界面的免疫水平。解郁育胞方是一個既能改善胚胎著床又沒有胚胎毒性的中藥復方制劑，本研究對于臨床助孕技術的心理應激輔助治療，從疏肝養肝的角度，改善子宮內膜容受性，提高對母胎界面的免疫保護作用，有利于胎兒在宮內生長發育而不被排斥，提高臨床妊娠率，療效與使用潑尼松無明顯差異，卻規避了致畸等副作用。