MTHFD1及FPGS和GGH基因多態性對大劑量甲氨蝶呤中樞療效的影響*

陳琴，何勁松，陳娟，趙秋玲，楊琳，謝瑞祥

(福建省腫瘤醫院、福建醫科大學附屬腫瘤醫院藥劑科，福州 350014)

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)是我國較常見的、起源于淋巴結及淋巴組織的惡性腫瘤。近年來其發病率呈持續上升趨勢，超過大部分惡性腫瘤的增長速度[1]。大劑量甲氨蝶呤(high-dose methotrexate，HD-MTX)可透過血-腦、血-眼等生理屏障[2]，是治療原發性中樞神經系統淋巴瘤和NHL中樞轉移的重要措施。HD-MTX的中樞治療效果存在個體差異。研究表明，藥物代謝過程關鍵酶的基因多態性與藥物療效的個體差異關系密切[3]。亞甲基四氫葉酸脫氫酶(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1，MTHFD1)是葉酸代謝過程的關鍵酶之一，催化四氫葉酸一碳單位交換的3個連續反應，在5，10-亞甲基四氫葉酸和10-甲酰四氫葉酸的生成中起重要作用，從而影響DNA合成[4]。MTHFD1基因變異導致其活性的差異不僅可以影響不同疾病的易感性，還可以調節抗葉酸化療藥物的療效[5]。

MTX進入體內后，在葉酰多聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase，FPGS)的作用下聚谷氨酸化，生成主要活性產物MTX 多聚谷氨酸鹽(MTXPGs)。γ-谷氨酰水解酶(gamma-glutamyl hydrolase，GGH)能夠將長鏈MTXPGs去谷氨酸化為短鏈MTXPGs，最終變成游離MTX，泵出細胞外。MTXPGs能在細胞內更持久更強效地發揮作用，研究顯示，FPGS和GGH的活性高低，會影響到細胞內主要活性代謝產物MTXPGs的濃度，可能影響MTX的療效[6-8]。

目前研究主要集中在MTHFD1、FPGS和GGH基因多態性與HD-MTX血藥濃度和不良反應的關系[9-11]，較少涉及中樞療效方面。本研究探討MTHFD1 rs2236225、FPGS rs10106和GGH rs1800909基因多態性對NHL患者MTX中樞治療效果的影響，以期為MTX的臨床個體化合理使用提供理論參考依據。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇我院2014年1月—2017年12月接受HD-MTX化療的原發中樞和中樞轉移的NHL患者。入選標準：漢族，年齡75歲以下，經病理組織學或細胞學確診為NHL，符合原發中樞或中樞轉移NHL的臨床診斷標準，卡氏功能狀態評分≥60分，預計生存期>3個月。排除標準：肝腎功能異常，其他嚴重并發癥、精神疾病患者、妊娠及哺乳期婦女。本研究經我院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2藥品、試劑和儀器 MTX注射液由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司提供(批號：13020512，14022416，15032215，1512015，170222AG)；血液基因組DNA提取試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供(批號：03611)；Platinum?Taq DNA聚合酶、聚合酶鏈反應(PCR)擴增緩沖液體系、定制的引物均由Life TechnologiesTM提供；基因檢測所用試劑由上海華大基因科技有限公司提供。

1.3MTHFD1、FPGS和GGH基因多態性檢測 MTX 劑量為2.0～3.5 g·(m2)-1，化療前常規給予靜脈補液，堿化尿液[12]。給藥前靜脈采血2 mL，加入依地酸二鈉(EDTA)抗凝管，顛倒混合后保存待用，采用Qiagen試劑盒提取DNA，使用紫外-分光光度計測定DNA的濃度與純度，選擇A260/A280(A值)在1～8的樣本為后續基因檢測標本。從Genbank上查得目標SNP的核苷酸序列，采用Primer3.0版軟件設計擴增目的片段引物序列，所有引物均委托公司合成。用美國 Sequenom 公司 MassARRAY 時間飛行質譜技術檢測位點基因多態性。

1.4MTX療效判定標準 根據美國國家綜合癌癥網絡指南中NHL的盧加諾緩解標準對患者化療后的療效進行評價[13]，CR為完全緩解，PR為部分緩解，PD為疾病進展，總緩解率為(CR+PR)/總例數×100%。

1.5統計學方法 應用SPSS22.0版統計軟件對數據進行處理，用擬合優度χ2檢驗考察MTHFD1、FPGS和GGH的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；用卡方檢驗來比較不同基因型與MTX療效之間的差異；納入年齡、性別、疾病分期、MTX劑量等因素進行多元回歸分析；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1患者基本資料 共納入71例原發中樞和中樞轉移的NHL患者(原發中樞43例，中樞轉移28例)，其中男42例，女29例，平均年齡(57.3±10.5)歲。病理分型彌漫性大B細胞淋巴瘤63例(88.73%)，T淋巴母細胞淋巴瘤8例(11.27%)。疾病分期I或II期患者40例，Ⅲ或Ⅳ患者31例。

2.2MTHFD1 rs2236225、FPGS rs10106和GGH rs1800909基因多態性分布情況 MTHFD1 rs2236225位點GG、GA和AA基因型的分布頻率分別為60.56% (43例)、33.80%(24例)和5.63%(4例)；FPGS rs10106位點GG、GA和AA基因型的分布頻率分別為54.93% (39例)、40.85%(29例)和4.23%(3例)；GGH rs1800909位點AA、AG和GG基因型的分布頻率分別為71.83%(51例)、22.54%(16例)和5.63%(4例)。各位點基因多態性分布符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)。

2.3MTHFD1 rs2236225、FPGS rs10106和GGH rs1800909基因多態性與療效的相關性分析 CR和PR患者共41例(57.75%)，PD患者30例(42.25%)。其中MTHFD1 rs2236225突變型患者化療后客觀緩解率明顯低于野生型患者(39.29%比69.77%，P=0.011)；納入年齡、性別、疾病分期、MTX劑量等因素進行多元回歸分析后，MTHFD1 rs2236225與療效仍然有顯著相關性(P=0.023)。見表1，2。

3 討論

遺傳基因的多態性可能會引起藥物體內過程中的轉運蛋白、代謝酶和作用靶點的活性改變，從而導致藥物療效的改變。MTHFD1 基因中研究比較多的位點是G1958A(rs2236225)，該位點發生突變時，原來的鳥嘌呤G被腺嘌呤A替代，導致谷氨酰胺代替精氨酸，降低 MTHFD1 的穩定性，從而可能減少MTHFD1對葉酸代謝的影響，降低MTX抑制腫瘤細胞增殖的作用[14]。KRAJINOVIC等[15]研究發現，MTHFD1 rs2236-225 突變會增加無事件生存率的風險。本研究檢測了71 例NHL患者的MTHFD1rs2236225位點基因型情況，發現MTHFD1基因多態性與MTX化療有效性之間存在相關性，攜帶突變型基因的患者化療后客觀緩解率明顯低于野生型基因攜帶者。推測原因是突變影響了代謝酶MTHFD1的熱穩定性，減少了酶的活性，從而降低了MTX的療效。

表1 MTHFD1 rs2236225、FPGS rs10106和GGH rs1800909基因多態性與療效的相關性分析Tab.1 Correlation analysis between the efficacy and gene polymorphisms of MTHFD1 rs2236225，FPGS rs10106 and GGH rs1800909

表2 MTHFD1 rs2236225與療效的多因素回歸分析Tab.2 Multivariate analysis of MTHFD1 rs2236225 and the efficacy

目前關于FPGS基因多態性與MTX療效的相關研究主要集中在FPGS rs1544105和FPGSrs10106，結果存在爭議。黃珍等[16]研究FPGS rs1544105 基因型與急性淋巴細胞白血病(ALL)患兒使用MTX化療敏感性的關系，發現該位點突變純合型患兒化療有效率高于突變雜合型和野生型患兒，提示FPGS rs15441505基因多態性會影響MTX療效；LIU等[17]、PANETTA等[18]研究卻發現FPGS rs15441505野生型活性比非野生型增強，野生型患兒MTX療效增加；而一項對內風濕性關節炎患者的研究顯示，FPGS rs10106不影響MTX化療敏感性[19]。

李越等[20]研究了FPGS和GGH的基因表達與MTX療效相關性，結果顯示，FPGS高表達組和低表達組復發率有顯著差異，提示FPGS基因表達水平對ALL患兒的療效有影響；而GGH基因表達水平與療效的相關分析無明顯相關性，提示GGH相對于FPGS，對MTXPG的濃度影響處于相對弱勢的地位，當FPGS表達較高致MTXPG達到一定量時，GGH基因表達水平才可能發揮作用。本研究未發現FPGS rs10106、GGHrs1800909基因多態性與MTX中樞療效的相關性，推測原因為：①FPGS和GGH的活性受調控區和編碼區多個位點基因多態性影響，每個位點的權重尚不清楚[21-22]；②本研究樣本數量較少，患者MTX的劑量、聯合用藥等情況的差異對療效影響的權重較大。

本研究結果提示MTHFD1 rs2236225的基因多態性與MTX中樞療效之間存在一定相關性，由于本研究的樣本數量較少，未來需要擴大規模來進一步明確該位點作為療效預測指標的可行性。