川芎酚酸提取純化及對缺氧神經細胞損傷的影響*

包永睿，王帥，楊欣欣，李天嬌，孟憲生

(1.遼寧中醫藥大學藥學院，大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心，大連 116600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室，大連 116600)

川芎為傘形科植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥根莖，為常用的活血行氣藥，具有活血行氣、祛風止痛的功效[1]，被廣泛用于治療經閉痛經、頭痛、風濕痹痛等。酚酸類成分是川芎中發揮藥效的一類主要特征成分，具有抗血小板聚集、清除氧自由基、擴血管等諸多作用[2-4]。隨著對川芎化學成分研究的不斷深入，分離純化得到更多、更純的一類藥效物質具有廣泛的經濟和社會效益。現有關于川芎酚酸類成分純化多采用D101、AB-8、DA201、DM301、D140等傳統常用樹脂；隨著科技的不斷發展，一些專用型、特異性樹脂隨之出現，為某一特定結構的提取純化提供了新方法。本實驗以此為出發點，采用單因素考察、正交設計等實驗方法，篩選川芎酚酸類成分最佳提取方法[5]；采用大孔吸附樹脂等技術，通過靜、動態吸附與解吸實驗，優選川芎酚酸類成分的最佳純化工藝[6-7]。同時通過體外藥效實驗研究酚酸類成分對缺氧神經細胞的保護作用，為該類成分在臨床的合理應用與工業生產提供參考。

1 實驗材料

川芎藥材(購于大連民大中藥有限公司，批號：C140135，經遼寧中醫藥大學許亮教授鑒定為LigusticumchuanxiongHort.的干燥根)；阿魏酸對照品(購于中國食品藥品檢定研究院，批號：110807-201306)；HPD-600、HPD-400、HPD-300、AB-8、NKA-9、D101、X-5大孔吸附樹脂均購于滄州寶恩有限公司；小牛血清(北京全式金生物技術有限公司)；人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y(購于中國科學院上海細胞庫)。

2 方法與結果

2.1川芎酚酸類成分提取工藝優選

2.1.1對照品溶液的制備 以阿魏酸為考察指標。精密稱取阿魏酸對照品適量，置50 mL量瓶中，加甲醇超聲使溶解，制得每毫升含0.046 6 mg的對照品溶液。

2.1.2標準曲線的繪制 參照總酚酸含量測定相關文獻報道，本實驗擬采用常用三氯化鐵-鐵氰化鉀比色法測定總酚酸含量[8]。精密吸取阿魏酸對照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，分別置25 mL量瓶中，加甲醇至6 mL，加0.3 %十二烷基硫酸鈉2 mL，0.6 %三氯化鐵-0.9 %鐵氰化鉀(1：1)混合液1 mL搖勻，在暗處放置5 min，加入1 mol·L-1的冰醋酸溶液至刻度，搖勻，暗處放置30 min，以顯色劑為空白，740 nm波長處測定吸光度。以濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，得回歸方程：A=105.69C-0.086 6(r=0.999 9，n=6)。阿魏酸對照品在0.046 6～0.161 0 mg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.1.3提取因素的考察 通過預實驗及相關文獻調研，以阿魏酸為考察指標，選取醇濃度、提取次數、提取時間、溶劑用量作為影響因素，通過L9(34)正交設計法進行優化[9-11]，實驗設計及結果見表1，方差分析見表2。

表1 川芎酚酸類成分提取工藝正交實驗結果Tab.1 Results of orthogonal experiment for the extraction process of Chuanxiong phenolic acid

表2 方差分析Tab.2 Variance analysis

F0.05(2，2)=19.00

由此可知，各因素影響程度依次為A>D>B>C，其中 A(乙醇體積分數)和D(溶劑用量)對提取結果有顯著性影響(P<0.05)。考慮到生產的實際情況，最終確定A因素為90%乙醇是最佳提取溶劑。在正交實驗結果的基礎上，對D(溶劑用量)因素進行細化分析，在10倍量的基礎上，對6，8，10，12倍量溶劑進行單因素考察，結果總酚酸含量分別為33.26，33.41，32.63，31.81 mg·g-1，可知溶劑用量為8倍量時，總酚酸含量最高，最終確定D因素為8倍量溶劑是最佳溶劑用量。因此，最優提取工藝為8倍量90%乙醇回流提取3次，每次2 h。

2.1.4工藝驗證實驗 為合理驗證正交實驗結果，平行稱取3份等量的藥材，按上述優化條件提取，驗證提取工藝的穩定性，總酚酸含量分別為33.13，32.22，32.87 mg·g-1，總酚酸平均含量為32.74 mg·g-1，RSD為3.47%，與正交實驗結果吻合，說明篩選出的提取工藝穩定可行，適合于實際生產應用。

2.2川芎酚酸類成分純化工藝優選

2.2.1靜態吸附與解吸實驗 精密稱取預處理好的HPD-600、HPD-400、HPD-300、AB-8、NKA-9、D101、X-5等7種樹脂各1 g，至100 mL具塞錐形瓶中，加入按最佳提取工藝制備的濃度為0.5 g·mL-1樣品溶液10 mL。每10 min振搖20 s，12 h后吸取一定體積上清液，紫外分光光度法測定含量；樹脂抽濾至干，邊抽濾，邊用水100 mL洗滌樹脂，90%乙醇20 mL解吸，4 h后吸取一定體積解吸液，紫外分光光度法測定含量。飽和吸附量(mg·g-1干樹脂)=[吸附前溶液濃度(mg·mL-1)-吸附后溶液濃度(mg·mL-1)]/干樹脂量(g)×吸附液體積(mL)；解吸率(%)=(解吸液濃度×解吸液體積)/(樹脂飽和吸附量)×100%。結果見表3。

表3 各大孔樹脂的靜態吸附與解吸實驗結果 Tab.3 Test results of static adsorption and desorption of various macroporous resin

通過靜態吸附實驗分析，綜合各樹脂總酚酸的飽和吸附量以及解吸率結果后，HPD-300型樹脂可以得到59.34 mg·g-1總酚酸，優于其他型號樹脂，最終確定HPD-300為實驗用樹脂。

2.2.2上樣藥液濃度考察 取預處理好的HPD-300樹脂10 mL4份，濕法上柱，將0.1 g·mL-1川芎提取液150 mL、0.2 g·mL-1川芎提取液75 mL、0.5 g·mL-1川芎提取液30 mL、0.8 g·mL-1川芎提取液20 mL，以每小時2倍體積(bed volume，BV)的流速上樣，用90 %乙醇各5 BV以2 BV·h-1流速進行洗脫，收集洗脫液，測定總酚酸的含量。各洗脫液中總酚酸含量分別為243.81，320.48，272.05，232.15 mg確定上樣藥液濃度為0.2 g·mL-1。

2.2.3泄露曲線考察 取預處理好的HPD-300樹脂10 g，濕法上柱，將0.2 g·mL-1川芎提取溶液以流速2 BV·h-1上樣，每10 mL收集一次流出液，測定總酚酸的含量。結果總酚酸在上樣量為60 mL時出現明顯泄露。綜合考慮，上樣量宜為50 mL，即每克樹脂的生藥材用量為1 g。結果見圖1。

圖1 泄露曲線考察Fig.1 Leaking curve

2.2.4上樣pH值考察 取預處理好的HPD-300樹脂10 g各5份，濕法上柱，取0.2 g·mL-1川芎提取液50 mL，分別用稀鹽酸、0.4%氫氧化鈉(NaOH)溶液調pH值至2，3，4，7，8，以2 BV·h-1的流速上樣，用90%乙醇各5 BV以2 BV·h-1流速進行洗脫，收集洗脫液，測定總酚酸的含量。結果上樣pH值為4時，總酚酸的解吸量最大，故確定pH值=4為最佳上樣pH值。結果見圖2。

圖2 上樣pH值考察Fig.2 Investigation on pH value of samples

2.2.5洗脫醇濃度考察 取預處理好的HPD-300樹脂10 g各5份，濕法上柱，取0.2 g·mL-1川芎提取液50 mL，以2 BV·h-1的流速上樣，分別用10%，30%，50%，70%，90%乙醇各5 BV，以2 BV·h-1流速進行洗脫，收集洗脫液，測定總酚酸的含量。結果90%乙醇能將總酚酸有效洗脫，故確定90%乙醇為最佳洗脫溶劑。結果見圖3。

2.2.6洗脫醇用量考察 取 HPD-300樹脂10 mL，濕法上柱，將0.2 g·mL-1川芎提取液50 mL ，以流速2 BV·h-1上樣，先用1倍量水(10 mL)除雜，再用90%乙醇進行洗脫，收集8份洗脫液(每份10 mL)，測定總酚酸的含量，繪制洗脫醇用量曲線。結果5倍量90%乙醇可將近全部總酚酸洗脫下來。故確定洗脫醇用量為5倍量90%乙醇。結果見圖4。

圖3 酚酸類成分洗脫醇濃度的考察Fig.3 Investigation on the concentration of elution alcohol of phenolic acid

圖4 酚酸類成分洗脫醇用量的考察Fig.4 Investigation on the dosage of elution alcohol of phenolic acid

2.2.7除雜體積考察 分別考察1，2，3，4，5BV水洗除雜體積，結果水洗液中總酚酸含量分別為0.10，0.13，0.20，0.24，0.23 mg，水洗除雜體積為2 BV時，酚酸類已有一部分損失，故選擇水洗除雜體積為1 BV。

2.2.8川芎酚酸類成分的二次純化及純化工藝驗證 經過大孔吸附樹脂一次純化后總酚酸的純度約為20%，因此采用連續過樹脂的方法將洗脫液按最佳純化工藝條件進行二次純化，平行稱取3份川芎藥材粉末，按最佳提取方法進行提取，并按最佳純化工藝進行兩次上柱，得到兩次純化產物，計算總酚酸的純度及收率，見表4。由數據結果可知該純化工藝穩定性、重復性良好，適合工業生產。分析其純度升高、收率降低較小的原因，其樹脂可能對酚酸成分吸附能力較強，而對其他成分富集較弱，間接證明該樹脂對酚酸專屬性較強。

2.3川芎酚酸類成分對缺氧神經細胞的保護作用 取對數生長期的人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y，在含體積分數為10%小牛血清的DMEM/F12培養條件下，接種于96孔培養板，每孔100 μL，培養約12 h，待細胞貼壁完全，設加藥實驗組[加藥物和4.5 mmol·L-1連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)造模劑]、空白對照組(只加細胞，不加藥物和造模劑)、模型對照組(加造模劑，不加藥物)，每組設5個復孔。繼續培養12 h后，每孔避光加5 mg·mL-1噻唑藍(MTT)20 μL，繼續培養4 h后吸凈孔內上清液，每孔加入二甲亞砜(DMSO)150 μL，搖床振搖10 min，酶標儀492 nm處掃描，測定吸光度值(A值)，計算存活率，細胞存活率(%)=實驗組A/空白對照組A×100%。見表5。

表4 工藝驗證結果Tab.4 Results of verification process %

表5 川芎酚酸類成分對缺氧損傷神經細胞的保護作用Tab.5 Protection phenolic acid in chuanxiong on hypoxic injury of neurocytes

實驗結果表明，一次純化組與二次純化組中1 g生藥所含酚酸量分別為28.05，26.38 mg，二者差別不大，但純度提升38%以后，藥效提升了近1倍。

3 討論

川芎為傳統常用中藥，目前國內相關研究多集中在化學成分、藥理作用、藥動學和質量控制等方面，針對川芎總酚酸研究相對較少，且總酚酸提取純化后純度較低，僅為51.7%。采用專用新型樹脂，在結構、極性方面對分離成分進行有針對性的富集，可以在原基礎上大幅度提高川芎總酚酸純度及收率，為增加有效部位新藥研制的瓶頸問題提供新的技術方案。筆者對川芎總酚酸的提取、純化工藝進行優化，考察了醇濃度、提取次數、提取時間、溶劑用量等提取條件及樹脂類型、上樣藥液濃度、上樣量、上樣pH值、洗脫醇濃度、洗脫醇用量等純化條件，獲得純度接近70%，收率為80%的高純度酚酸類成分。實驗結果表明，工藝穩定可靠，適合工業生產，可以為川芎工業生產提供參考。同時，本研究對其不同純度的酚酸類成分進行了基于缺氧神經細胞損傷保護作用的體外藥效實驗，結果表明酚酸類成分隨著純度提高，神經保護作用顯著增強，呈一定時間、劑量與效應關系，表明川芎酚酸為川芎藥材神經保護作用藥效物質組分，在后續開展純化物成分解析實驗的基礎上，為其臨床合理利用及新藥開發奠定基礎。