復(fù)制蛋白A1和A2在肝細(xì)胞癌患者癌組織中的表達(dá)及臨床意義*

王肖澤 田學(xué)軍 蒙 軒

1.清華大學(xué)玉泉醫(yī)院普外科 (北京， 100040) 2.中國人民解放軍總醫(yī)院肝膽外科

原發(fā)性肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，占癌癥死亡的第二位，在我國原發(fā)性肝癌的發(fā)病率較高，給醫(yī)療資源及患者生活帶來較大負(fù)擔(dān)[1]。原發(fā)性肝癌根據(jù)病理組織來源，常規(guī)可分為3類肝內(nèi)膽管癌、混合性肝癌以及肝細(xì)胞癌，其中超過90.51%的患者為肝細(xì)胞癌[2,3]。雖然原發(fā)性肝癌的臨床診治技術(shù)和相關(guān)研究均取得了較大進(jìn)步，但仍有大量患者因?yàn)椴∏榉磸?fù)或治療無效而死亡。隨著分子疾病學(xué)的不斷發(fā)展，眾多學(xué)者開始將基礎(chǔ)疾病的發(fā)病機(jī)制與人體細(xì)胞通道或蛋白分泌通道相聯(lián)系。有研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌的產(chǎn)生與人體“三多因素(多蛋白、多基因、多步驟)”有關(guān)[4]，其中復(fù)制蛋白A(RPA)是在DNA代謝過程中發(fā)揮重要作用的主要真核細(xì)胞結(jié)合蛋白(單鏈DNA)，但是RPA各亞單位如何具體影響疾病發(fā)生和進(jìn)展，仍需進(jìn)一步研究[5～7]。本研究探討RPA在肝細(xì)胞癌患者癌組織中的表達(dá)及臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 隨機(jī)選取2018年1月至2018年6月期間，在我院治療的肝細(xì)胞癌患者60例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者經(jīng)病理證實(shí)為肝細(xì)胞肝癌；暫時(shí)未接受過任何治療；肝功能Child-Pugh A級或B級；暫無其他部位轉(zhuǎn)移；無重要器官損害；患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有其他惡性腫瘤(或其他類型肝癌)者；存在明顯凝血功能障礙者；患有其他疾病，病情危重而不宜手術(shù)者；精神或意識(shí)不正常，無法配合正常手術(shù)的患者。另有30例肝臟良性腫瘤手術(shù)患者作為對照組，在術(shù)中留取肝組織待測。

1.2 檢測項(xiàng)目及方法 ①采集患者入院初基本情況包括性別、肝癌細(xì)胞分化程度、TNM分期、乙肝病毒表面抗原、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及門脈癌栓等情況。②比較不同預(yù)后患者治療前后RPA1、RPA2表達(dá)含量，根據(jù)改良實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(CIST)進(jìn)行預(yù)后評估，分為完全緩解、部分緩解、疾病穩(wěn)定、疾病進(jìn)展。③RPA1、RPA2含量檢測：組織穿刺或術(shù)中留取組織來取得標(biāo)本，包括癌組織或正常組織，當(dāng)即用生理鹽水洗凈后放入凍存管(提前放入去RNA酶)中進(jìn)行低溫保存。采用Western blotting方法進(jìn)行檢測，取樣品中80.0mg組織，提取蛋白，按照BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)說明書進(jìn)行操作，最后利用SDS-PAGE電泳進(jìn)行轉(zhuǎn)模、封閉及顯色。取出條帶晾干，照相。將膠片進(jìn)行掃描(或高清拍照)，測定目的條帶的灰度值，用以表示RPA1、RPA2的含量。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者RPA1和RPA2表達(dá)情況 見表1。

2.2 不同情況肝細(xì)胞癌患者RPA1表達(dá)情況 見表2。

2.3 不同情況肝細(xì)胞癌患者RPA2表達(dá)情況 見表3。

2.4 不同預(yù)后的肝細(xì)胞癌患者RPA1和RPA2表達(dá)情況 見表4。

表1 肝癌患者與健康人群RPA1、RPA2表達(dá)比較

表2 不同情況肝細(xì)胞癌患者RPA1表達(dá)水平比較

與TNMⅠ期比較，*P<0.05；與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，△P<0.5

表3 不同情況肝細(xì)胞癌患者RPA2表達(dá)水平比較

與低分化比較，#P<0.01；與TNMⅠ期比較，*P<0.05；與有門脈癌栓比較，★P<0.05

表4 不同預(yù)后的肝細(xì)胞癌患者RPA1、RPA2表達(dá)水平比較

3 討論

肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、以及轉(zhuǎn)移，與細(xì)胞的損傷修復(fù)過程密切相關(guān)，多位學(xué)者提出，人體的多種抑癌基因(P53、APC、Rb)和原癌基因都參與其中[8～10]。在DNA延長和復(fù)制起始階段，RPA蛋白發(fā)揮著關(guān)鍵作用，也有研究發(fā)現(xiàn)[11,12]，在DNA的損傷修復(fù)階段RPA也起著重要作用。因此，基因組的不穩(wěn)定與腫瘤的發(fā)生有著密切關(guān)系，而在肝細(xì)胞癌發(fā)展過程中腫瘤細(xì)胞的異常生長需要DNA的大量復(fù)制和充足的修復(fù)能力[13,14]，所以，我們可以推斷RPA1、RPA2參與了肝癌的形成。本研究分析RPA1、RPA2在肝細(xì)胞癌和肝臟良性腫瘤患者肝癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明肝細(xì)胞癌患者RPA1和RPA2的表達(dá)高于肝臟良性腫瘤患者，且前者的高表達(dá)與患者的性別、HBV感染，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無關(guān)，而與癌細(xì)胞分化程度、TNM分期、門脈癌栓存在一定關(guān)聯(lián)。肝癌細(xì)胞分化程度越高、腫瘤分期為Ⅲ、Ⅳ期以及有門脈癌栓的患者肝癌組織中RPA1、RPA2表達(dá)更高，提示肝細(xì)胞癌患者病情越嚴(yán)重，其RPA1、RPA2表達(dá)水平相對越高。近年來有研究證實(shí)，RPA(特別是RPA2)能夠與P53抑癌基因相互作用，導(dǎo)致野生型P53抑癌基因的活性下降，使得受損的DNA通過細(xì)胞周期的檢測，腫瘤細(xì)胞更容易形成[15～18]。同時(shí)，RPA可以直接影響到堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、雙鏈斷裂修復(fù)三個(gè)主要過程，進(jìn)而影響到腫瘤細(xì)胞異常生長時(shí)DNA三大過程(復(fù)制、修復(fù)、凋亡)，還可影響到腫瘤細(xì)胞的生理活性及疾病的病理特征。因此，我們認(rèn)為RPA1、RPA2的高表達(dá)能夠作為判斷肝細(xì)胞癌惡性程度及患者預(yù)后的重要參考指標(biāo)。對這兩個(gè)特異性蛋白表達(dá)水平進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，有助于了解患者病情，并預(yù)測其發(fā)展[19～21]。有研究顯示，肝細(xì)胞癌患者體內(nèi)TNF-α、甲胎蛋白等炎性因子均會(huì)有顯著上升，而miR-590-5p和miR-590-3p等基因表達(dá)也有明顯增加，至于RPA1、RPA2水平與上述指標(biāo)是否存在聯(lián)系，仍需進(jìn)行深入研究。

隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，肝細(xì)胞癌的治療方法逐漸增多，包括手術(shù)、局部消融、介入治療、放療、藥物治療等，術(shù)后總生存率也有所提高，但最新的研究結(jié)果顯示，肝癌仍是預(yù)后最差的一種腫瘤[22～24]。本研究結(jié)果顯示，預(yù)后不樂觀的患者肝癌組織中RPA1、RPA2表達(dá)水平顯著高于預(yù)后完全緩解的患者，由此，也可以將RPA1、RPA2水平作為判斷肝癌患者預(yù)后緩解的一個(gè)指標(biāo)。從另外一個(gè)角度來說，我們可以嘗試通過分子靶向治療技術(shù)，對肝細(xì)胞癌患者的臨床治療進(jìn)行新的嘗試。分子靶向治療是近些年迅速發(fā)展的一種腫瘤治療方式，其作用機(jī)理為利用腫瘤細(xì)胞與健康細(xì)胞間的分子生物學(xué)差異，采用一系列措施靶向性地抑制腫瘤細(xì)胞生長，加速腫瘤細(xì)胞死亡[25]。有研究表明RPA可能是細(xì)胞毒性藥物的靶點(diǎn)，本研究的結(jié)果也證實(shí)RPA的表達(dá)與癌組織間有著密切關(guān)系，但由于本研究所納入的病例數(shù)有限，并不能得出確切結(jié)論，RPA1、RPA2表達(dá)水平能否作為肝細(xì)胞癌惡性程度評估的重要指標(biāo)仍需進(jìn)一步深入研究。