特異性敲除CD147基因抑制小鼠非酒精性脂肪性肝炎的機制研究*

沈曉雯 戴世榮 黃琳玲

江蘇省南通市第二人民醫院檢驗科 (江蘇 南通, 226001)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) 主要是由肝細胞內脂肪堆積引起，會發展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，甚至肝癌[1]。NASH進展的主要因素是肝細胞凋亡與炎癥反應，其嚴重程度與肝細胞的凋亡程度呈正相關，肝細胞在受損時會激活炎癥通路，釋放細胞因子調控疾病的進展[2，3]。CD147基因在多種腫瘤細胞及炎癥組織中廣泛表達，與親環蛋白等發生關鍵作用，有助于釋放促炎細胞因子[4，5]。早前研究發現CD147基因參與了肝纖維化的形成，促進了腫瘤的發生[6]。目前，尚不明確CD147基因在NASH中的表達情況與作用，故筆者研究CD147基因在肝臟疾病早期炎癥階段中的作用，探討其可能的病理生理作用機制，為臨床早期抑制NAFLD、NASH等肝臟疾病提供新的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 造模與分組 購買BALB/c基因敲除小鼠12只(雌雄不限，上海斯萊克實驗動物有限責任公司)，鼠齡8周，體質量(13±4) g。打耳標標記并剪取少量尾巴，提取全基因組DNA，經鑒定符合肝細胞特異性敲除CD147基因小鼠，其中6只采用蛋氨酸-胱氨酸缺乏飼料(MCD)喂養簡稱A1組，另6只采用正常飼料喂養簡稱A2組。另12只為沒有敲除CD147基因小鼠，其中6只也采用MCD喂養簡稱B1組，另6只采用正常飼養喂養，簡稱B2組。兩周后處死小鼠，測定其血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-18(IL-18)、NLR家族Prin域3(NLRP3)，并檢測B細胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax蛋白)等表達。觀察小鼠肝細胞凋亡情況。

1.2 材料與試劑 胎牛血清(FBS,美國Hyclone公司)；RPMI-1640細胞培養液(美國GIBCOBRL公司)；四甲基偶氮唑(MTT，進口分裝,華美生物工程公司)；二甲基亞砜(DMSO，分析純)購自江蘇鴻聲；Western Blot試劑、免疫熒光試劑購自上海碧云天；0.25%胰酶購自吉泰科技；免疫組化試劑(SP9000試劑盒、DAB顯色劑)購自北京中杉金橋；RT-PCR逆轉錄試劑盒、SYBR Green I Mix PCR試劑(日本Takara公司)；ECL發光液(美國Thermo Scientific公司)；美國Millipore公司的PVDF膜(0.45 μm)；美國Millipore公司的EZH2多克隆抗體；美國Santa Cruz公司的辣根過氧化物酶標記二抗；美國GIBCO公司的RPMI 1640培養液；美國Applied biosystems公司的PT-PCR反應用96孔板；上海生工公司合成的RT-PCR引物；上海吉瑪生物技術有限公司的mRNA模擬物片段及對照片段；美國Invitrogen公司的Lipofect AMINE 2000細胞轉染試劑；美國Life 技術公司的TRlzol試劑及反轉錄試劑；廣州市銳博生物科技有限公司的Cell-LightTMEdU Apollo 567 In vitro Kit檢測試劑盒。

1.3 儀器與設備 3111型CO2培養箱、CL17R型冷凍高速離心機均購自Thermo Forma公司；低溫冰箱購自SANYO公司；SW-CJ-1F層流超凈生物學工作臺(蘇州安泰)；ELX808酶聯免疫檢測儀(美國BioTek公司)；丹麥NUN CLON公司的細胞培養板和培養瓶；日本Olympus公司的XPS-18型倒置熒光顯微鏡；美國Bio-Rad公司的蛋白印記檢測系統與凝膠成像儀；Step One PLUS熒光定量PCR儀，羅氏480熒光定量PCR儀，Leica Bond-Max免疫組化儀，Bio-Rad S1000梯度PCR儀。

1.4 試驗方法

1.4.1 qRT-PCR檢測全基因組DNA 采用TaKaRa公司生產的Trizol試劑分別提取處理細胞的總RNA，定量后依照TaKaRa公司的反轉錄試劑盒說明書嚴格操作制備cDNA。利用上海生物工程公司合成引物，將GAPDH為內參照物，采用SYBR Green法定量檢測以下mRNA表達水平。CD147-LoxP引物序列，上游5′-ATAGAAATGGGGATGCTCTG-3′，下游5′-GGCTCTGTCTTCACTTGG-3′；Alb-Cre引物序列，上游5′-ACAGCTCCCAGATGGCAAACATAC-3′，下游5′-ATCACTCGTTGCATCATGACCG-3′。取逆轉錄產物于Real-time PCR儀上進行擴增并檢測熒光。反應體系為：2×Taq PCR Master Mix 5μl，上游引物(15μmol/L)0.5μl，下游引物(15μmol/L)0.5μl，cDNA1μl，用DEPC處理水補齊20μl。PCR反應條件：94℃預變性3min，活化Tag酶；92℃ 30s，58℃ 60s，72℃ 30s，共循環34次。以上每組均設復孔3個，重復3次，按照2-ΔΔCT法統計定量分析以上mRNA 的表達水平。

1.4.2 法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達 分別提取4組小鼠肝臟組織的總蛋白，使用BCA試劑盒檢測各指標濃度，利用8 %十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳50 μg總蛋白，濕轉法并轉膜，用5 %脫脂牛奶封閉1 h加入1∶200稀釋的一抗，4 ℃搖床中孵育12 h。完成后再使用TBST清洗3次，10 min/次，接著加入1∶300稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗，再重復以上清洗，最后采用Pierce公司生產的超敏ECL試劑暗室曝光檢測蛋白條帶，以內參的灰度值為100 %進行比較和半定量分析。

1.4.3 qRT-PCR檢測相關的細胞因子RNA 同小鼠肝組織的總RNA提取方法一致，在擴增目的片段的同時以18 S作為內參對照，重復測定3次。其中18 S引物序列，上游5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′，下游5′-CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG-3′；IL-1β引物序列，上游5′-GAACCAACAAGTGATATTCTCCATG-3′，下游5′-GATCCATACTATCCAGGCTGCA-3′；IL-18引物序列，上游5′-GACTCTTGCGTCAACTTCAAGG-3′，下游5′-CAGGCTGTCTTTTGTCAACGA-3′；NLRP3引物序列，上游5′-ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3′，下游5′-TCGCAGCAAAGATCCACACAG-3′。

1.4.4 肝組織脂肪蘇木精-伊紅(HE)染色 4組小鼠肝臟石蠟切片65 ℃烤箱中30 min，依次放入二甲苯、無水乙醇中個5 min，放入2個95 %乙醇中各2 min，80 %、75 %乙醇、蒸餾水中各2 min。接著進行蘇木精染色10 min，1 %鹽酸乙醇分化，蒸餾水沖洗后在PBS中反藍5 min，伊紅染色5 min，蒸餾水沖洗置于95 %乙醇中10 s，依次放入無水乙醇、二甲苯中各2 min，最后中性樹膠封片。

1.4.5 肝組織脂肪油紅O染色 小鼠肝組織冰凍切片用甲醛-鈣液固定10 min，蒸餾水洗3 min，60 %異丙醇浸洗3 min，油紅O染色10 min，60 %異丙醇分化至無色，蒸餾水沖洗后，蘇木精復染5 min，自來水藍化3 min，最后甘油明膠封片。

1.4.6 血清ALT、AST檢測 在96孔板中進行反應，每組設置6個重復孔。在37℃孵箱內5 μl小鼠血清與20 μl基質液混勻，氣浴30 min，各孔中加入0.4 mol/L氫氧化鈉200μl，振蕩10 min，混勻后靜置15 min。采用酶標儀在510 nm處吸光度A值，并繪制生長曲線計算相應酶活單位。

1.4.7 小鼠肝細胞凋亡檢測 石蠟組織放入二甲苯I、II中各5 min脫蠟，接著依次浸泡在100 %乙醇5 min，90 %、80 %、70 %的乙醇中3 min。接著依次滴加100 μl 蛋白酶K溶液、3% 過氧化氫-甲醇溶液，室溫孵育20 min、5 min，結束后TBS漂洗增加組織的通透性以及滅活內源性過氧化氫酶活性；接著滴加100 μl 1×TdT平衡溶液，繼續孵育30 min，去液后滴加100 μl的TdT標記混合液，37 ℃孵育90 min，結束后TBS漂洗，滴加100 μl終止緩沖液，孵育5 min，TBS漂洗。最后，滴加100 μl封閉緩沖液，室溫孵育10 min，去液后滴加100 μl稀釋過的偶聯物，繼續孵育30 min，TBS漂洗，滴加100 μl DAB顯色液，繼續孵育15 min，去離子水漂洗，然后滴加100 μl甲基綠復染，繼續孵育3 min，依次浸入2～4次無水乙醇與二甲苯，蓋玻片封片，進行顯微鏡鏡檢。

2 結果

2.1 MCD喂養的兩組小鼠脂肪組織兩種染色情況 HE染色與油紅O染料染色結果均顯示，A1組小鼠在2周時的脂肪變性程度明顯弱于B1組小鼠，其主要特征為脂肪空泡面積縮小。見插頁彩圖1。

圖1 MCD 喂養的兩組小鼠肝臟脂肪組織染色圖

2.2 4組小鼠ALT、AST水平測定結果 見表1。

表1 4組小鼠ALT和AST水平比較

A2組比較，*P< 0.05；與B2組比較，△P< 0.05；與B1組比較，#P< 0.05

2.3 MCD喂養的兩組小鼠肝脂肪組織染色情況 見插頁彩圖2。當MCD誘導后，A1組小鼠肝組織內肝細胞的凋亡數量明顯少于B1組(P<0.05)。

圖2 MCD 喂養的兩組小鼠肝細胞凋亡圖（（Tunel 染色，×200））

2.4 4組小鼠Bax、Bcl-2蛋白表達水平檢測結果 見表2。

表2 4組小鼠Bax、Bcl-2的表達水平比較

與A2組比較，*P< 0.05；與B2組比較，△P< 0.05；與B1組比較，#P< 0.05

2.5 4組小鼠肝組織中IL-1β、IL-18、NLRP3檢測結果 見表3。

表3 4組小鼠肝組織IL-1β、IL-18、NLRP3表達比較

與A2組比較，*P< 0.05；與B2組比較，△P< 0.05；與B1組比較，#P< 0.05。

3 討論

NASH病程進展的主要因素有肝細胞死亡、炎癥反應和細胞因子釋放等[7]。CD147基因能誘導基質細胞，降解細胞外基質，參與腫瘤的代謝過程，促進腫瘤進展；同時，CD147基因也參與調控眾多免疫性疾病，對炎性與促炎細胞因子的釋放發揮關鍵的作用[5,8]。已有研究報道采用Cre-LoxP系統構建肝細胞特異性敲除不同基因小鼠，且肝細胞中不同基因敲除不影響小鼠的正常生長[9,10]。鑒于早前研究顯示NASH小鼠CD147基因在肝細胞中表達較明顯，本研究建立肝細胞特異性敲除CD147基因的NASH小鼠模型，研究其抑制小鼠NASH的發展，探究其可能的作用機制。

NASH進展的初始表現為肝細胞內脂肪大量積累，超過了肝組織代謝能力而發生一系列應激反應、肝功能紊亂，加速NASH病程進展[11]。吳明兵等采用渥曼青霉素處理高脂飲食飼養的非酒精脂肪肝模型小鼠，發現小鼠的體質量、肝功能、胰島素抵抗、葡萄糖抵抗及肝臟脂肪指數變化均明顯小于高脂飲食單獨喂食的小鼠，同時結果顯示渥曼青霉素處理小鼠CMKLR1和NLRP3的表達下調，KCs介導的炎性反應減弱，這可能是通過Chemerin/CMKLR1途徑抑制Kupffer細胞NLRP3的活性緩解小鼠肝臟脂肪變性以及炎性反應[12]。吳強等研究發現CD147基因與周圍型非小細胞肺癌的淋巴轉移有關，其陽性表達與腫瘤的大小、深分葉征、棘突征、縱隔淋巴結腫大有關，表明CD147基因參與肺癌的侵襲轉移[13]。何拓等綜述了CD147基因在肝細胞癌、乳腺癌及宮頸病變中的作用，發現CD147基因常常會被激活并重新表達，而且通過多種機制可以促進腫瘤的侵襲和轉移，在腫瘤的惡性生物學行為中扮演了重要角色[14]。吳海燕等發現在小鼠肝癌細胞Hepa1-6細胞可通過其CD147基因及其配體CypA作用，促進其自身細胞增殖，并同時影響CypA對T細胞的趨化能力，進而逃避T細胞的免疫監視作用[15]。以上研究表明CD147基因可以調節脂肪酸代謝促進肝癌細胞的增殖與轉移，通過多種途徑參與脂肪代謝與脂肪細胞的分化，提示CD147基因在NASH中可能參與促進肝細胞內部脂肪變性。本研究結果提示小鼠特異性敲除CD147可以減弱NASH引起的脂肪組織變性。CD147基因被認為具有抗凋亡作用，可以促進腫瘤細胞的存活[16]。本研究結果還提示特異性敲除CD147基因可以減弱NASH引起的小鼠肝細胞損傷，抑制NASH疾病進展，減弱NASH引起的肝細胞凋亡。

NASH發展過程中會發生明顯的炎癥應答，刺激炎癥通路，釋放炎癥因子，激活肝星狀細胞與Kupffer細胞的功能，促進肝臟纖維化[10,17]。IL-1β與IL-18是IL-1家族的細胞因子，參與了炎性小體NLRP3的炎癥信號轉導過程，而IL-1β不僅能促進肝星狀細胞的增殖和活化，還加速肝癌惡化，而Kupffer細胞、肝細胞在NASH中能釋放大量的IL-1β[18，19]。在NASH的病理變化過程中，肝細胞會經歷脂質積累、死亡以及氧化應激反應導致肝纖維化，最終癌變。本研究采用qRT-PCR的方法檢測了相關的細胞因子IL-1β、IL-18在小鼠肝臟組織中的表達情況，結果提示小鼠肝細胞特異性敲除CD147基因可以減弱NASH引起的肝細胞炎癥反應。

綜上所述，在NASH中敲除CD147基因能夠減輕肝組織脂肪變性、減少肝細胞凋亡(下調促凋亡分子Bax水平，上調抗凋亡分子Bcl-2水平)和細胞因子IL-1β、IL-18、炎性小體NLRP3的表達，最終抑制NASH進展。