黛礬散對原發(fā)性膽汁性膽管炎小鼠肝細(xì)胞膜多重藥物抗性相關(guān)蛋白2的影響*

程良斌嚴(yán)駿松 周金輝

1.湖北省中醫(yī)院肝病研究所 (湖北 武漢， 430061) 2.武漢市第六醫(yī)院消化科 3.上海市閔行區(qū)中醫(yī)院消化科

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)，又名原發(fā)性膽汁性肝硬化，是一種病因不明的慢性進(jìn)行性的膽汁淤積性肝病，其典型病理表現(xiàn)為非化膿性膽管炎或肉芽腫性膽管炎，以小膽管破壞為主。治療方面，除熊去氧膽酸(UDCA)的療效受到肯定外暫無特效治療；而中藥在治療該病的臨床實(shí)踐中取得了一定療效。根據(jù)PBC的臨床表現(xiàn)，本病當(dāng)屬中醫(yī)黃疸病的“瘀黃疸癥”范疇，血瘀血熱、瘀熱交阻常為膽汁淤積的成因。我們前期的研究證實(shí)，中藥黛礬散及組分能不同程度拮抗α-奈異硫氰酸脂所致膽管損傷引起的肝內(nèi)膽汁淤積[1]。為進(jìn)一步探究黛礬散治療PBC的機(jī)理，我們擬采用聚肌胞苷酸(PolyⅠ:C)誘導(dǎo)PBC小鼠模型，觀察黛礬散及其各組分對其肝臟血清學(xué)生化、肝臟組織學(xué)改變及肝細(xì)胞多重藥物抗性相關(guān)蛋白2(MRP2)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雌性C57BL/6小鼠60只，體重(20±2)g，由湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK(鄂)2015-0018。

1.2 主要試劑及藥物 PolyⅠ:C購自美國Sigma公司(批號：31852-29-6)，用之前以無菌PBS稀釋至1 mg/ml；黛礬散(青黛和明礬比例1:8)由湖北省中醫(yī)院藥劑科提供，用之前以1%阿拉伯膠配成相應(yīng)濃度，熊去氧膽酸(UDCA)為德國LosanPharma GmbH產(chǎn)品(批號：H20050181)，用之前以1%阿拉伯膠配成5mg/ml溶液。

1.3 分組與處理 實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為正常組(A)、模型組(B)、明礬組(C)、青黛組(D)、黛礬散組(E)及熊去氧膽酸組(F)。除A組小鼠外，其余5組小鼠以poly I∶C腹腔注射(5mg/kg)，1次/3天，A組小鼠以等體積的生理鹽水腹腔注射，連續(xù)16周。A、B組小鼠以1%阿拉伯膠灌胃(0.1ml/kg/d)，C組小鼠以青黛灌胃(0.12g/kg/d)，D組小鼠以明礬灌胃(0.96g/kg/d)，E組以黛礬散灌胃(1.08g/kg/d)，F(xiàn)組以熊去氧膽酸灌胃(15mg/kg/d)，連續(xù)16周。16周后處置動物，采血分離血清，留取肝組織制備肝勻漿和病理切片。

1.4 檢測指標(biāo)及方法 常規(guī)生化檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBil)、堿性磷酸酶(ALP)；采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(ELISA)檢測抗線粒體抗體(AMA)，觀察肝組織病理變化，采用RT-PCR方法檢測多重藥物抗性相關(guān)蛋白2(MRP2) mRNA表達(dá)水平,采用Western-blot方法檢測MRP2蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果 見表1。

2.2 各組小鼠MRP2基因mRNA水平 見表2。

表1 各組小鼠生化指標(biāo)檢測結(jié)果比較

與正常組比較， *P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

表2 各組小鼠MRP2基因mRNA比較

與正常組比較， *P<0.05；與模型組比較， △P<0.05

2.3 各組小鼠MRP2蛋白表達(dá)情況 與正常組比較，模型組MRP2水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各治療組分別有不同程度的升高，其中黛礬散組和熊去氧膽酸組升高顯著(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組小鼠MRP2蛋白電泳圖

2.4 各組小鼠肝組織病理學(xué)變化 A組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，門管區(qū)無明顯病變；B組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)存在，肝細(xì)胞普遍中-重度變性，門管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤及纖維組織輕度增生，向周圍肝組織穿插，呈早期肝硬化趨勢；C組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)存在，肝細(xì)胞普遍中-重度變性，門管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤；D組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)存在，肝細(xì)胞普遍中-重度變性，門管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤、血管擴(kuò)張；E組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)存在，肝細(xì)胞普遍中-重度變性，門管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤、纖維組織輕度增生；F組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)存在，肝細(xì)胞普遍中-重度變性，門管區(qū)少許炎癥細(xì)胞浸潤、小膽管增生。見插頁彩圖2。

圖2 各組小鼠肝組織病理圖（HE，×100）

3 討論

PBC的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前已知其機(jī)制與免疫、遺傳易感性、化學(xué)物質(zhì)及感染因素相關(guān)。在治療方面，目前UDCA是唯一被國際指南均推薦用于治療PBC的藥物[2]，對UDCA生物化學(xué)應(yīng)答欠佳的患者，目前尚無統(tǒng)一治療方案[3],奧貝膽酸(obeticholic acid)是近年來研究的治療PBC的新藥，可顯著改善PBC患者的生化指標(biāo)，但嚴(yán)重不良事件的發(fā)生率也較高[4]，肝臟移植是治療終末期PBC唯一有效的方式。我國有關(guān)PBC的研究正處于起步階段，PBC患者的臨床表現(xiàn)多以乏力及皮膚瘙癢最為常見，當(dāng)屬中醫(yī)“瘀黃疸癥”的范疇，血瘀、血熱、瘀熱交阻常為膽汁淤積的成因[5]。我們前期的臨床研究表明，運(yùn)用中藥黛礬散在治療肝內(nèi)膽汁淤積癥具有良好的臨床療效及安全性[6]；而我們前期的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黛礬散能顯著降低雌激素所致肝內(nèi)膽汁淤積大鼠的TBA、TBil、ALT及ALP水平，增強(qiáng)肝勻漿及肝竇膜中Na+-K+-ATPase、Mg++-ATPase活性，且可加強(qiáng)肝細(xì)胞竇膜及毛細(xì)膽管膜的流動性[7，8]；黛礬散及其組分能不同程度拮抗ANIT所致膽管損傷所導(dǎo)致的肝內(nèi)膽汁淤積[1]。

MRP2主要在肝細(xì)胞表達(dá)，定位于毛細(xì)膽管面，主要負(fù)責(zé)膽紅素和其它膽汁成分的排泄。各種因素導(dǎo)致其缺陷可引起高膽紅素血癥和膽汁流的障礙。陳應(yīng)果[9]等人的研究表明，梗阻性黃疸大鼠其MRP2在轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均明顯降低，肝細(xì)胞對膽紅素的排泄障礙，導(dǎo)致或進(jìn)一步加重機(jī)體的高膽紅素血癥;國外研究也表明，在膽汁淤積模型中，MRP2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)均降低[10]。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青黛組、礬石組、黛礬散組及UDCA組AMA、ALP均較模型組顯著降低，MPR2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平較模型組也有不同程度的升高；病理結(jié)果示：黛礬散及其組分能不同程度拮抗PolyⅠ:C誘導(dǎo)的門管區(qū)炎癥及膽管上皮損傷。綜上所述，黛礬散及其組分能不同程度促進(jìn)應(yīng)用PolyⅠ:C 建立的PBC小鼠模型的MRP2基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，這可能是黛礬散治療PBC的藥理學(xué)作用機(jī)制之一。