重組桿狀病毒表達豬圓環病毒2型Cap蛋白的優化及蛋白免疫原性研究

李天增，潘曉梅，張偉，師小瀟，徐龍飛，賀筍

(天康生物股份有限公司，烏魯木齊830032)

豬圓環病毒病 (Porcine circovirus disease，PCVD) 是由豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)引起的豬傳染性疾病，自1997年Clark等首次分離PCV2以來，該病已給全世界養豬業造成了巨大的經濟損失。目前，PCV2在我國豬群中普遍存在，能夠引起免疫抑制、混合感染和繼發感染，嚴重危害養豬業的發展[1-3]。

PCV2屬于圓環病毒科、圓環病毒屬，病毒無囊膜，病毒粒子直徑約為17 nm，基因組為單鏈環狀DNA，大小為l767 bp或1768 bp，有11個閱讀框，其中ORF1和ORF2是最主要的閱讀框。ORF2大小為702 bp，編碼233個氨基酸，是病毒的主要結構蛋白(核衣殼蛋白)[4]，具有良好的免疫原性，是構建重組疫苗和檢測的首選基因，目前已在不同系統中得到有效表達[5-7]。因此，本試驗利用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統對PCV2-rCap蛋白優化表達進行了研究，以期為今后開發PCV2亞單位疫苗奠定基礎。

1 材 料

1.1 重組病毒株 重組病毒株vBac-SP-PCV2由天康生物股份有限公司構建和保存。High-five 細胞購自Invitrogen公司。

1.2 試劑 Ni-NTA Purification System為Invitrogen公司產品；蛋白預染Marker購自Thermo Fisher 公司；辣根過氧化物酶標記兔抗豬二抗購自Sigma公司；豬源PCV2多克隆抗體由天康生物股份有限公司制備。TEMED購白北京鼎國生物技術有限公司；咪唑為SIGMA公司產品，其他試劑為進口或國產分析純試劑。

2 方 法

2.1 vBac-SP-PCV2表達條件的優化

2.1.1 High five細胞濃度的確定 用SFX培養基將High five細胞濃度調整為1.0×106/mL、1.5×106/mL、2.0×106/mL、3.0×106/mL，每瓶總量100 mL，分別加入2 MOI病毒感染量重組桿狀病毒，細胞置于26～28 ℃培養箱中振蕩培養，分別于接毒后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、192 h、216 h、240 h定時取樣，每次收集5 mL細胞混懸液。

2.1.2 病毒感染量和蛋白表達時間的確定 用SFX培養基將High five細胞濃度調整為2×106/mL，總量100 mL，分別加入0.25、0.5、1、1.5、2、3 MOI病毒感染量重組桿狀病毒，細胞置于26～28 ℃培養箱中振蕩培養，分別于接毒后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、192 h、216 h、240 h定時取樣，每次收集5 mL細胞混懸液。

2.2 表達產物的分析 將以上收取樣品于4 ℃以10000 r/min離心10 min，收集表達后細胞沉淀，加入裂解液，于冰浴中進行超聲破碎10 min(功率200 W，1/2探頭，破碎30 s，間歇30 s)，超聲結束后于4 ℃以12000 r/min離心10 min，分別取上清進行Western blotting分析。

2.3 重組蛋白的純化和濃縮 將大批表達PCV2-rCap蛋白的細胞液以10000 r/min離心10 min收集細胞沉淀，超聲破碎，離心收集上清，用His Bind Purification Fits進行純化。將細胞裂解物10～15 mL加入準備好的含有8 mL填料的純化柱中。4 ℃輕柔振蕩結合過夜，以保持細胞裂解產物能始終混懸填料。靜止，讓Ni-NTA瓊脂糖填料靠重力的作用自己沉降完全澄清。放出上清液，上清液取樣。將30 mL PBS加入純化柱中，不斷輕柔換向扣敲純化柱混懸Ni-NTA瓊脂糖。靜止，讓Ni-NTA瓊脂糖填料靠重力的作用自己沉降完全澄清。放出上清液，PBS洗脫2次。上清液取樣存放于4 ℃進行SDS-PAGE分析。固定好柱子，使用5 mL的洗脫液洗脫蛋白。收集1 mL的洗脫液用于SDS-PAGE分析, BCA法檢測蛋白濃度。

2.4 Cap蛋白純化濃縮產物的SDS-PAGE和Western blotting分析 取蛋白樣品60 μL與20 μL 4×上樣buffer混合，進行SDS-PAGE及Western blotting分析。然后將SDS-PAGE膠上的蛋白條帶轉移到PVDF膜上，置含5%的脫脂奶粉的PBST中，4 ℃封閉30 min，清洗，加入稀釋1∶500倍一抗豬源PCV2多克隆抗體，4℃緩慢振蕩過夜；清洗，加入稀釋1∶5000倍含辣根過氧化物酶標記的兔抗豬的二抗，室溫作用1 h，清洗，于暗室內進行顯色。

2.5 純化蛋白的電鏡觀察 將純化濃縮蛋白吸取3 μL鋪在經特殊處理的噴碳的銅網上，1 min后用濾紙吸干，用5%磷鎢酸pH7.0負染1 min，干燥后用電子顯微鏡進行觀察蛋白分子形狀。

2.6 純化的PCV2-rCap免疫原性試驗 純化蛋白配制疫苗，免疫豚鼠，以相同劑量相同方式分別進行二次免疫。免疫后每周采血，離心取血清，采用IFA檢測PCV2 Cap蛋白抗體效價。56 ℃水浴槽30 min。在PCV2抗原盤蓋子上寫好標示。將所有孔加入75 μL 3% PBA。在第1排每孔加入25 μL血清樣品 (第1排血清稀釋倍數為4倍)。之后為連續4倍稀釋血清。第12排為陰性空白對照孔(PCV2陰性血清樣本)。置于4 ℃感作12 h。去除一抗后，每孔加入200 μL的PBST，洗板4次。將每孔的PBST倒干后，每孔加入以1% PBA 稀釋二抗Goat anti mouse FITC 50 μL，置25 ℃感作4 h。去除二抗后，每孔加入200 μL的PBST，洗板 4次。將每孔的PBST倒干后，再加入50 μL PBST，并于倒立熒光顯微鏡下判讀熒光細胞。

3 結果與分析

3.1 最佳蛋白表達條件的確定

3.1.1 最佳High five細胞濃度的確定 重組PCV2-rCap蛋白表達試驗，按2MOI接種病毒時，當細胞密度不低于2.0×106/mL，培養時間為168 h，蛋白含量最高。

3.1.2 最佳病毒感染量和蛋白表達時間的確定 以2.0×106/mL High five細胞濃度，不同病毒感染量、蛋白表達時間進行蛋白表達條件優化，根據不同的接毒量和表達時間表達的重組PCV2-rCap蛋白(細胞沉淀超聲后上清)Western blotting AlphaEaseFC軟件灰光度值分析結果，篩選出表達量相對較高的0.25 MOI(168 h和192 h)、0.5 MOI(192 h和216 h)、1 MOI(168 h)、1.5 MOI(168 h)、2 MOI(144 h)、3 MOI(168 h)8個桿狀病毒表達的重組PCV2-rCap蛋白，進行下一步的最佳接毒量和表達時間的篩選試驗。由圖1 AlphaEaseFC軟件灰光度值分析結果：確定2.0×106/mL High five細胞濃度、1.5 MOI病毒感染量、蛋白表達時間168 h為重組PCV2-rCap蛋白表達的最佳條件。

3.2 重組蛋白的純化和濃縮 將細胞沉淀超聲破碎離心收集上清用His Bind過柱純化，收集洗脫液進行Western blotting分析，圖2結果表明，在純化濃縮液中蛋白條帶大小與重組蛋白吻合，說明重組蛋白已經得到純化，且純度較高。

3.3 純化重組蛋白用于Western blotting中蛋白質定量分析 BCA法檢測純化蛋白濃度約1 mg/mL。Western blotting中蛋白質定量分析，稀釋的標準蛋白采用軟件線性擬合曲線分析R2=0.99，在可信度范圍(R2≥0.95)之內，可用于蛋白定量分析。

3.4 純化PCV2-rCap蛋白的電鏡觀察 PCV2b ORF2基因編碼蛋白經昆蟲細胞表達系統表達后具有正常的結構和功能，能夠形成病毒樣顆粒，大小均勻，直徑為20 nm左右(圖3)。

圖3 純化濃縮重組蛋白的病毒樣顆粒圖(100nm)Fig 3 Virus-like particle diagram of purifiedrecombinant protein concentration (100nm)

3.5 純化的PCV2-rCap免疫原性試驗 純化蛋白配制疫苗，免疫豚鼠，免疫7日后即有抗體產生，免疫21日后所有豚鼠抗體均轉陽，免疫28日抗體達到較高水平(圖4、圖5)，表明蛋白的免疫原性好，能高效誘導機體產生良好的體液免疫。

圖4 IFA檢測PCV2陽性血清抗體結果(彩圖)Fig 4 IFA detection of PCV2 positive serumresults (color map)

4 討論與結論

桿狀病毒表達系統為高效表達外源蛋白表達體系，目的蛋白在昆蟲細胞內能夠正確折疊、二硫鍵的搭配及寡聚物的形成，表達產物在結構及功能上接近天然蛋白[8]。病毒感染復數、病毒感染時間、細胞密度等是影響桿狀病毒表達系統為高效表達的關鍵因素[9-10]，因此本研究對影響桿狀病毒表達系統為高效表達的關鍵因素進行探討研究優化。結果顯示，當細胞密度不低于2.0×106/mL時，隨著病毒感染復數增加到一個臨界值1.5MOI后，蛋白表達量不再增加；隨著病毒感染時間延長，蛋白表達量不斷增加，168 h為峰值，192 h蛋白表達量略有下降，進一步說明病毒感染復數和病毒感染時間是影響蛋白表達量的重要因素。

圖5 免疫豚鼠PCV2抗體結果分析圖Fig 5 Results of immune guinea pigPCV2 antibody analysis

本研究利用昆蟲細胞桿狀病毒表達系統表達了Cap蛋白，電鏡觀察顯示形成了病毒樣顆粒，同時在重組蛋白的C末端設計了His.tag序列，外源基因與組氨酸標簽融合表達，為重組蛋白的純化創造了條件[11-12]，提高了純化效率，同時不會因為插入組氨酸標簽影響外源基因蛋白的活性，為進一步研發豬圓環病毒的亞單位疫苗奠定了基礎。

蛋白百分比定量方法定量是基于普通的蛋白電泳，目的蛋白處有可能有降解的蛋白沉降此處，會導致蛋白定量偏高。而Western blotting分析是指將蛋白質樣品經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉移至到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，然后用抗體通過免疫學反應檢測目的蛋白，是抗原抗體的特異性反應[13]，因此本試驗的定量更為準確。