白僵菌多糖對腫瘤細胞及免疫細胞作用的研究

宋志強　丁祥　朱淼　唐賢　侯怡鈴

摘要本文通過使用酶標儀檢測白僵菌多糖刺激B淋巴細胞和小鼠結腸癌細胞CT26.WT后分別得到的OD值，對白僵菌多糖在機體免疫活性和抗腫瘤方面的作用進行研究。結果表明，用不同濃度的白僵局多糖刺激B淋巴細胞時，細胞數量增加，成團量變大;用不同濃度的白僵菌多糖刺激CT26.WT細胞時，細胞數量減少或有被抑制的趨勢。由此說明，白僵菌多糖能夠促進B細胞的增殖，抑制CT26.WT細胞的生長。

關鍵詞 白僵菌;多糖;B淋巴細胞;CT26.WT細胞

中圖分類號 R285.5

文獻標識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）07-0187-02

白僵菌（Beauweria?bassiana）是一種病原真菌類的蟲生真菌，具有較強的抗蟲害作用，并且容易人工培養，主要用于害蟲的防治16。真菌多糖是真菌中的有效生物活性成分，能夠增強機體的免疫功能，并在抗腫瘤方面發揮出一定的積極作用17-8。

目前，對于白僵菌多糖的報道僅見于芽生孢子內的糖原及其代謝的檢測，然而與白僵菌多糖對免疫活性的調節和抗腫瘤作用相關的研究尚未見報道%。本試驗通過使用不同質量濃度的白僵菌多糖溶液分別刺激B淋巴細胞和小鼠結腸癌細胞CT26.WT，并結合酶標儀檢測白僵菌多糖對B淋巴細胞和小鼠結腸癌細胞CT26.WT的影響，為進一步研究白僵菌多糖對機體免疫功能和抗腫瘤功能的影響提供了理論依據。

1材料與方法

1.1主要材料與儀器

1.1.1試驗材料。白僵菌（保存于西華師范大學生命科學學院西南野生動植物資源保護省部共建教育部重點實驗室）;B淋巴細胞、小鼠結腸癌細胞（CT26.WT）（中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所）;96孔板、25cm2細胞培養瓶[康寧生命科學（吳江）有限公司]。

1.1.2藥品試劑。RPMI1640培養基、胰蛋白酶（美國Gibeo公司）;脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，上海源葉生物科技有限公司）;CCK-8試劑盒（cell?counting?kit-8，上海博升生物科技有限公司）;PBS緩沖液。

1.1.3主要儀器。Epoch酶標儀（美國基因有限公司）;SE-CJ-1F型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）;3100系列CO2恒溫培養箱（美國Thermo公司）;LD4-2A型離心機、BCD-208K/A型-80C冰箱（青島海爾股份有限公司）;HHS型水浴鍋（上海光地儀器設備有限公司）;Eppendorf移液槍[艾本德（上海）國際貿易有限公司]。

1.2試驗方法

1.2.1溶液的配制。配制質量濃度為1mg/mL的白僵菌多糖母液并加入細胞培養液稀釋，配制成質量濃度為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、30.00μg/mL的白僵菌多糖溶液。配制質量濃度為1mg/mL的LPS母液并加入細胞培養液稀釋，配制成質量濃度為10μg/mL的LPS溶液。

1.2.2B淋巴細胞、CT26.WT細胞的培養。用培養液將B淋巴細胞和CT26.WT細胞稀釋至2x10%細胞/mL，配制成細胞懸浮液。向96孔板樣品孔四周加入PBS緩沖液，其余孔中分別加人細胞懸浮液。試驗設置為空白對照組、LPS陽性對照組（終質量濃度5μg/mL）和白僵菌多糖試驗組（終質量濃度0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、15.000μg/mL），在37C、5%的二氧化碳培養箱中培養24h。

1.2.3白僵菌多糖刺激B淋巴細胞CT26.WT細胞。向96孔板的空白對照組、試驗組（終質量濃度為0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、15.000μg/mL）和LPS陽性對照組（終質量濃度為5μg/mL）中分別加入細胞培養液和質量濃度為1.25、2.50.5.00、10.00、20.00、30.00μg/mL的白僵菌多糖溶液以及質量濃度為10μg/mL的LPS溶液，每個濃度梯度設置6個重復。充分混勻后放在37C、5%的二氧化碳培養箱中恒溫培養24h。

1.2.4酶標儀檢測。將培養24h后的細胞從恒溫培養箱中取出，并分別取5μLCCK-8試劑加入96孔板內，在37C、5%的二氧化碳培養箱中孵育3h，再用酶標儀在450nm的激發波長下檢測OD值并記錄作圖。

2結果與分析

2.1白僵菌多糖對B細胞的增殖作用

由圖1可知，當白僵菌多糖的終質量濃度為0.625～15.000μg/mL時，能夠明顯看出B細胞呈現增殖狀態。當終質量濃度為5μg/mL，促進B細胞增殖的效果最好，相比于空白對照組具有極顯著性差異（P<0.01）。

B淋巴細胞增殖形態如圖2所示，從圖中可以看出，具有良好生長狀態的B細胞加入白僵菌多糖刺激后，B細胞成團量變大，增殖能力逐漸增強，并且當用5μg/mL濃度的白僵菌多糖刺激B細胞時，B細胞的成團量最大且增殖效果最好。

2.2白僵菌多糖對CT26.WT細胞的抑制作用

由圖3可知，當白僵菌多糖的終質量濃度為0.625～15.000μg/mL時，能夠明顯看出小鼠結腸癌細胞CT26.WT的生長被抑制了。當終質量濃度為2.500μg/mL時，抑制CT26.WT細胞增殖的效果最好，相比于空白對照組具有極顯著性差異（P<0.01）。

3結論

B淋巴細胞作為人體免疫重要的一道防線，可正向調節各種免疫成分和機體的免疫反應，對機體的免疫活性調節發揮作用10-1。CT26.WT細胞則是以N-nitroso-N-methylu-rethane-（NMU）誘導BALB/C小鼠形成的未分化結腸癌細胞，CT26.WT細胞具有極強的侵襲性，對機體免疫會產生較大的危害13。

由試驗結果可知，白僵菌多糖在0.625～15.000μg/mL的濃度范圍內，均能夠促進B淋巴細胞增殖，且增殖效應與白僵菌多糖的質量濃度成正相關。濃度為0.625～5.000μg/mL的白僵菌多糖試驗組與空白對照組相比具有極顯著性差異（P<0.01）。

白僵菌多糖在0.625～15.000μg/mL的濃度范圍內，均能夠抑制CT26.WT細胞增殖和生長，且抑制效應與白僵菌多糖的質量濃度成正相關。濃度為2.5μg/mL的白僵菌多糖試驗組與空白對照組相比具有極顯著性差異（P<0.01）。

綜上所述，在體外試驗中一定濃度的白僵菌多糖能夠促進B淋巴細胞增殖，抑制CT26.WT細胞增殖，進而達到保護機體的作用，但涉及的相關免疫機制、腫瘤機制及分子信號通路還有待進一步驗證。

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