曲馬多復合加巴噴丁對糖尿病神經病理性疼痛大鼠脊髓膠質細胞活化的影響

姚 杰，劉 斐，高 艷，龐茜茜，郭 穎，滕金亮

0 引言

糖尿病神經病理性疼痛(Diabetic neuropathic pain，DNP)是一類較難治療的疼痛類型，大約有50%的糖尿病患者有不同程度的疼痛發生[1]。作為治療DNP的一線藥物，加巴噴丁的鎮痛作用機制尚未明確。有研究表明，其可能的作用機制是抑制大鼠脊髓星狀膠質細胞和小膠質細胞的活化，從而減輕神經病理性疼痛[2]。但臨床上單獨應用加巴噴丁的鎮痛效果不夠理想，需要聯合應用其他治療慢性疼痛的藥物來達到較好的鎮痛效果以及減少大劑量使用加巴噴丁帶來的不良反應。曲馬多是一種選擇性中樞μ受體激動劑[3]。本研究通過建立1型糖尿病大鼠神經病理性疼痛模型，分組給藥后觀察曲馬多復合加巴噴丁對DNP的鎮痛效應，以及對DNP大鼠脊髓膠質細胞活化和炎癥因子表達的影響，進一步探討曲馬多聯合加巴噴丁治療DNP的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠，6～7周齡，體重200～220 g，動物許可證號：SYXK(滬)2017-0019，由中國人民解放軍海軍醫學研究所提供。

主要試劑：鏈脲佐菌素(STZ)，CAS號：18883-66-4，貨號：S6838，規格：100 mg/瓶，購自北京諾博萊德科技有限公司。使用時采用檸檬酸鈉緩沖液(pH值4.2～4.5)配制成6 mg/ml STZ溶液，置于冰上避光保存，并于30 min內使用；鹽酸曲馬多注射液(批號：105902，湖北潛江制藥股份有限公司)；加巴噴丁(批號：170206BD，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)；水合氯醛，購自成都嘉葉生物科技有限公司；小鼠抗大鼠小膠質細胞IBal抗體(北京中杉金橋公司)，兔抗大鼠星狀膠質細胞GFAP抗體(北京中杉金橋公司)，山羊抗小鼠FITC熒光二抗(北京中杉金橋公司)；TNF-α和IL-1的ELISA試劑盒(批號：CSB-E13482、CSB-E14754，武漢博士德生物有限公司)。

主要儀器：電子Von Frey測痛儀 (North coast公司)，BME-410A熱照射疼痛刺激儀(中國醫學科學院生物醫學工程研究所)，血糖測量儀及試紙(三諾公司)。

1.2 動物模型制備 選擇健康雄性SD大鼠48只，動物飼養環境安靜，通風良好，室溫約23 ℃，相對濕度50%，明暗周期交替，實驗動物可自由攝取食物及飲水，3 d后實驗動物適應環境開始進行實驗。1型糖尿病模型的建立是通過腹腔注射鏈脲佐菌(60 mg/kg)，注藥后第3天取大鼠尾部血液測定血糖，大鼠血糖高于15.5 mmol/L，視為1型糖尿病建模成功[4]。繼續飼養3周后，測定大鼠后足機械縮足閾值(PWT)，PWT<80%基礎值即為糖尿病神經病理性疼痛模型建立成功，此次有40只大鼠造模成功，糖尿病大鼠發生神經病理性疼痛的比例是87%。

1.3 動物分組及給藥 采取隨機數字表的方法分成4組(每組10只)：A組(生理鹽水組)、B組(曲馬多20 mg/kg組)、C組(加巴噴丁60 mg/kg組)及D組(曲馬多10 mg/kg+加巴噴丁30 mg/kg組)。

1.4 行為學測定 測定給藥前1 d (T0)及給藥后3 d (T1)、7 d (T2)、11 d (T3)時PWT和熱縮足潛伏期(PWL)。參照文獻[4]采用的方法測定PWT。將準備測試大鼠放置于帶金屬網格的有機玻璃籠，環境保持安靜，待其適應環境30 min后，使用Von Frey測痛儀的刺激針刺激大鼠左側足底，記錄被測大鼠縮足前最大垂直壓力，即為大鼠的PWT。重復刺激3次，間隔大于10 s，取其平均值作為PWT。參照文獻[5]采用的方法測定PWL。將準備測試大鼠放置于帶金屬網格的有機玻璃籠，環境保持安靜，待其適應環境30 min后，使用BME-410A熱照射疼痛刺激儀照射大鼠左側足底，記錄被測大鼠從開始照射至出現縮足反應的時間，即為大鼠的PWL。重復刺激3次，間隔5 min，取其平均值作為PWL。

1.5 膠質細胞免疫熒光雙染 大鼠行為學PWT和PWL測試結束后，在各組隨機抽取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，開胸，經心臟生理鹽水快速灌注，4%多聚甲醛灌注固定，分離并取脊髓腰膨大段組織，標本置于4%多聚甲醛固定3 h后，30%蔗糖梯度脫水，石蠟包埋，冰凍，制成10 μm石蠟切片，漂洗后封閉。二甲苯脫蠟，組織抗原修復，雙氧水封閉內源性過氧化物酶；滴加5%的BSA常溫封閉1 h，分別滴加一抗(Iba-1，濃度1∶200)和一抗(GFAP，濃度1∶200)，4 ℃過夜。次日PBS沖洗，加二抗，DAB顯色，蘇木精復染，陰性對照用PBS代替，樹膠封片后顯微鏡下拍片觀察實驗結果，含有棕黃色顆粒的細胞為陽性細胞。采用LEICAQ500MC圖像分析系統，在脊髓背角深層和淺層分別選取脊髓內側固定區域250 μm×250 μm范圍，計數陽性細胞，反映星狀膠質細胞和小膠質細胞活化水平。

1.6 ELISA法檢測TNF-α和IL-1含量 取清洗后的大鼠脊髓腰膨大段組織，加入5 ml預冷PBS沖洗研磨，離心5 min后取上清液，采用相應的試劑盒檢測脊髓提取液中的TNF-α、IL-1含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 不同治療組各時間點PWT的比較 各組大鼠T0時PWT比較差異無統計學意義(P>0.05)。與T0時比較，A組T1～T3時PWT差異無統計學意義(P>0.05)。B組T1～T3時PWT略有上升，差異無統計學意義(P>0.05)。C組T2時PWT升高，差異有統計學意義(P<0.05)。D組T2、T3時PWT升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與A組比較，C組和D組PWT升高(P<0.05)；與B組比較，C組和D組PWT升高(P<0.05)；與C組比較，D組T3時PWT升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 不同治療組各時間點PWL的比較 各組大鼠T0時PWL比較差異無統計學意義(P>0.05)。與T0時比較，A組T1～T3時PWL差異無統計學意義(P>0.05)。B組T2時PWL延長，差異有統計學意義(P<0.05)。C組T1、T2時PWL均延長，差異有統計學意義(P<0.05)。D組T1～T3時PWL延長，差異有統計學意義(P<0.05)。與A組比較，B組T2時PWL延長；C組T1、T2時PWL延長；D組T1～T3時PWL延長，差異有統計學意義(P<0.05)。與B組比較，D組T3時PWL延長(P<0.05)；與C組比較，D組T3時PWL延長(P<0.05)。見表2。

表1 各組糖尿病神經病理性疼痛大鼠PWT比較(mN)

注：△與T0時比較，P<0.05；*與A組比較，P<0.05；#與B組比較，P<0.05；&與C組比較，P<0.05

表2 不同治療組糖尿病神經病理性疼痛大鼠PWL比較(s)

注：△與T0時比較，P<0.05；*與A組比較，P<0.05；#與B組比較，P<0.05；&與C組比較，P<0.05

2.3 不同治療組脊髓內膠質細胞活化水平的比較 與A組比較，B組、C組、D組大鼠脊髓內星狀膠質細胞和小膠質細胞活化水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與B組比較，C組大鼠脊髓內星狀膠質細胞和小膠質細胞活化水平略降低，差異無統計學意義(P>0.05)，D組大鼠脊髓內星狀膠質細胞和小膠質細胞活化水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與C組比較，D組大鼠脊髓內星狀膠質細胞和小膠質細胞活化水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同治療組脊髓膠質細胞活化水平比較(個)

注：*與A組比較，P<0.05；#與B組比較，P<0.05；&與C組比較，P<0.05

2.4 不同治療組大鼠脊髓TNF-α、IL-1含量的變化 與A組比較，B組、C組、D組大鼠脊髓TNF-α、IL-1的表達降低明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。與B組、C組比較，D組大鼠脊髓TNF-α、IL-1的表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同治療組大鼠脊髓TNF-α、IL-1含量變化(ng/ml)

注：*與A組比較，P<0.05；#與B組比較，P<0.05；&與C組比較，P<0.05

3 討論

糖尿病已經成為我國重大公共衛生問題，DNP作為糖尿病的常見慢性并發癥，其臨床表現主要為自發疼痛和痛覺敏化[6]。目前，臨床上DNP的患者數量增加，長期的疼痛不適對患者的身心造成嚴重的損害。DNP的發病機制復雜，目前尚無有效的治療方案。以往對于DNP治療的研究大多集中在單獨應用加巴噴丁[7]，作為推薦使用的治療DNP的一線藥物[8]，其作用機制可能是通過中樞性鎮痛與抑制影響損傷后外周神經異位放電的作用[9-11]；通過激活類膽堿通路參與鎮痛作用[12-14]。但效果不夠理想，患者常處于鎮痛不全的狀態，并且同時伴有不同程度的眩暈、行走不穩、嗜睡、疲勞感等不良反應[15]。曲馬多是中樞性鎮痛藥，可以選擇性地激動μ受體，有鎮痛效果確切、成癮性低、抗膽堿以及鎮靜不良反應小等優點[16]。但曲馬多是中效鎮痛藥物，對癥狀較重的患者鎮痛不完善，增大劑量雖可提高療效，但隨之增加的抗膽堿、鎮靜等不良反應使患者無法長期耐受。為了解決在DNP治療上藥物療效和不良反應之間的矛盾，本研究通過將這兩種藥物聯合應用治療1型糖尿病大鼠神經病理性疼痛，觀察不同濃度藥物組合對DNP大鼠的鎮痛效應，以及對DNP大鼠脊髓膠質細胞活化和炎癥因子表達的影響，進一步探討曲馬多聯合加巴噴丁治療DNP的作用機制。

本研究選擇6～7周齡、體重200～220 g的雄性SD大鼠作為研究對象。一是因為低齡和低體重的大鼠對于傷害性刺激較敏感，二是因為雄性大鼠相對于雌性大鼠在疼痛行為學監測方面不受雌激素周期影響。

本研究中，DNP模型痛閾檢測結果顯示，腹腔注射20 mg/kg曲馬多對DNP大鼠機械縮足閾值無明顯影響，給藥后7 d熱縮足潛伏期延長，而腹腔注射60 mg/kg加巴噴丁后可產生明顯的鎮痛效應，與汪一等[17]報道結果相似。20 mg/kg曲馬多在單獨應用時對糖尿病大鼠機械縮足閾值無明顯影響，而在聯合加巴噴丁后則可產生明顯的鎮痛效應。與60 mg/kg加巴噴丁組比較，聯合曲馬多后在第7天、第11天時機械縮足閾值升高，熱縮足潛伏期延長，提示小劑量曲馬多和加巴噴丁聯合應用后，能夠有效減輕糖尿病神經病理性大鼠的痛覺過敏，使加巴噴丁的有效鎮痛時間延長，聯合用藥后10 mg/kg曲馬多同樣出現鎮痛效果。

近年來，大量研究表明，脊髓小膠質細胞在DNP的發生發展過程中起著關鍵作用[18-19]，而小膠質細胞是炎癥因子TNF-α、IL-1的主要來源[20]。本研究結果表明，與生理鹽水組比較，各組大鼠脊髓內星狀膠質細胞和小膠質細胞活化水平降低，脊髓TNF-α、IL-1的表達降低。與60 mg/kg加巴噴丁組比較，聯合用藥組大鼠脊髓內星狀膠質細胞和小膠質細胞活化水平以及脊髓TNF-α、IL-1的表達降低更明顯。提示曲馬多復合加巴噴丁可以抑制脊髓膠質細胞激活，減少炎癥因子釋放，從而緩解糖尿病神經病理學疼痛的發生，但是具體通過何種通路影響脊髓膠質細胞及炎癥因子的表達，還有待于進一步研究。

綜上所述，曲馬多復合加巴噴丁的鎮痛效果優于單獨應用曲馬多或加巴噴丁，其機制可能與抑制膠質細胞的活化，并減少TNF-α、IL-1的表達有關。