補陽還五湯對特發性肺纖維化模型大鼠肺組織內皮間質轉化的影響及其機制研究

楊邯捷 趙惠亮 渠景連 譚蕓 王俊霞

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）20-2757-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.05

摘 要 目的：探討補陽還五湯對特發性肺纖維化（IPF）模型大鼠肺組織內皮間質轉化（EndMT）的影響，并探討其可能機制。方法：將雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、地塞米松組[0.405 mg/（kg·d）]和補陽還五湯低、中、高劑量組[6.435、12.87、25.74 g/（kg·d），以生藥總質量計]，每組8只。除正常組外，其余各組大鼠均于氣管內注射博來霉素以復制IPF模型。自造模后第2天起，正常組和模型組大鼠均灌胃水[10 mL/（kg·d）]，各給藥組大鼠灌胃相應藥物，每日1次，連續28 d。末次給藥24 h后，采用免疫組化法檢測大鼠肺組織中內皮細胞標志物[血小板內皮細胞黏附分子1、血管內皮細胞鈣黏蛋白]和間質細胞標志物[α-平滑肌肌動蛋白、成纖維細胞特異性蛋白1]的表達情況，采用蛋白質印跡法檢測大鼠肺組織中Notch4、DLL4的表達情況。結果：與正常組比較，模型組大鼠肺組織中內皮細胞標志物的表達水平均顯著降低，間質細胞標志物以及Notch4、DLL4的表達水平均顯著升高（P<0.01）。各給藥組大鼠肺組織中內皮細胞標志物的表達水平均顯著高于模型組，補陽還五湯低劑量組上述指標顯著低于地塞米松組;間質細胞標志物以及Notch4、DLL4的表達水平均顯著低于模型組，補陽還五湯低劑量組上述指標顯著高于地塞米松組（P<0.05或P<0.01）。結論：補陽還五湯可通過干預EndMT來減輕大鼠的IPF，其機制可能與抑制DLL4/Notch4信號通路有關。

關鍵詞 特發性肺纖維化;補陽還五湯;內皮間質轉化;內皮細胞標志物;間質細胞標志物;DLL4/Notch4信號通路;機制;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of Buyang huanwu decoction on endothelial-mesenchymal transformation （EndMT） of lung tissue in idiopathic pulmonary fibrosis （IPF） model rats， and to explore its potential mechanism. METHODS： Male SD rats were randomly divided into normal group， model gorup， dexamethasone group [0.405 mg/（kg·d）]， Buyang huanwu decoction low-dose， medium-dose and high-dose groups [6.435， 12.87， 25.74 g/（kg·d）， by raw material]， with 8 rats in each group. Except for normal group， other groups were given endotracheal injection of bleomycin to induce IPF model. On the second day after modeling， normal group and model group were given water intrgastrically [10 mL/（kg·d）]; administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 28 days. 24 h after last medication， the expression of endothelial cell markers [platelet endothelial cell adhesion molecule 1， vascular endothelial cell cadherin] and interstitial cell markers [α-smooth muscle actin， fibroblast specific protein 1] were detected by immunohistochemistry method. The expression of Notch4 and DLL4 in lung tissue of rats were detected by Western blotting assay. RESULTS： Compared with normal group， the expression of endothelial cell markers were decreased significantly in lung tissue of model group， while the expressipon of interstitial cell markers， Notch4 and DLL4 were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the expression of endothelial cell markers in lung tissue of rats were increased significantly in administration groups， while Buyang huanwu decoction low-dose group was significantly lower than dexamethasone group; the expression of interstitial cell markers， Notch4 and DLL4 were decreased significantly， while Buyang huanwu decoction low-dose group was significantly higher than dexamethasone group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Buyang huanwu decoction can relieve IPF of model rats by intervening in EndMT， the mechanism of which may be associated with inhibiting DLL4/Notch4 singaling pathway.

KEYWORDS? ?Idiopathic pulmonary fibrosis; Buyang huanwu decoction; Endothelial-mesenchymal transformation; Endothelial cell marker; Interstitial cell marker; DLL4/Notch4 singaling pathway; Mechanism; Rats

特發性肺纖維化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種慢性纖維化性間質性肺炎，臨床主要表現為進行性呼吸困難或刺激性干咳，其病情呈持續性進展，最終可導致患者呼吸衰竭而亡[1]。目前，IPF的發病機制尚未完全闡明，肺泡上皮損傷后修復異常被認為是該病的主要發生機制[2]。但有研究表明，內皮間質轉化（Endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）也是IPF發生、發展的重要機制之一[3]。EndMT是指在特定的生理條件下，內皮細胞的形態由鵝卵石樣轉變為細長梭形，同時其遷移能力和侵襲能力顯著增強的病理過程。在此過程中，內皮細胞特異性標志物[如血管內皮細胞鈣黏蛋白（VE-cadherin）、血小板內皮細胞黏附分子1（CD31）等]的表達逐漸減弱或喪失，而間質細胞的特異性標志物[如α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、成纖維細胞特異性蛋白1（FSP-1）等]逐漸上調[4]。近期研究認為，包括DLL4/Notch4等在內的Notch信號通路在EndMT過程中發揮著重要作用[5]。其中，Notch4受體主要分布于血管內皮細胞中，DLL4配體作為一種重要的血管生長發育調節因子，也主要在內皮細胞內表達，兩者的特異性結合可啟動細胞內的信號傳導，從而調節血管的發育、成熟及穩定[5-6]。

中醫學理論認為，IPF的主要病機為氣虛血瘀，益氣活血是其基本治法[7]。補陽還五湯出自清代名醫王清任的《醫林改錯》，是益氣活血的代表方劑，可有效防治IPF[8]?，F代藥理研究表明，補陽還五湯能夠通過抑制IPF模型大鼠肺組織轉化生長因子β1（TGF-β1）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、α-SMA等的過度表達，降低支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子的含量，減輕肺泡炎癥反應，減少肺纖維化瘢痕形成，從而發揮抗肺纖維化作用[9-10]。本課題組前期研究表明，補陽還五湯含藥血清可一定程度上抑制人肺動脈內皮細胞的間質轉化，這種作用可能與調控Jagged1/Notch1通路的信號傳導有關[11]。在此基礎上，本研究以EndMT為切入點，進一步探討了補陽還五湯對IPF模型大鼠肺組織EndMT的影響，并從DLL4/Notch4信號通路出發分析其可能機制，以期為闡明該方劑防治IPF的作用機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1510型多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;ChemiDocTM XRS+型凝膠成像系統、PowerPacTM Basic型電泳儀（美國Bio-Rad公司）;BX53型光學顯微鏡（日本Olympus公司）;RM2265型切片機、1150H型包埋機（德國Leica公司）;Allegra X-30R型離心機（美國Beckman公司）;PL303型電子天平[梅特勒-托利多（上海）儀器公司];WGL-65B型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;T10BS25型電動勻漿器（德國IKA公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

生黃芪（批號：180108，產地：甘肅）、當歸（批號：171016，產地：甘肅）、赤芍（批號：161201，產地：甘肅）、地龍（批號：170801，產地：廣東）、川芎（批號：170701，產地：四川）、桃仁（批號：171101，產地：山東）、紅花（批號：170901，產地：新疆）等飲片均購自貴陽同仁堂藥房，經貴州中醫藥大學藥學院孫慶文教授鑒定，分別為豆科植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao]的干燥根、傘形科植物當歸[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根、毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根、鉅引科動物參環毛蚓[Pheretima aspergillum（E. Perrier）]的干燥體、傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖、薔薇科植物桃[Amygdalus persica（L.）]的干燥成熟種子、菊科植物紅花（Chelonopsis tinctorius L.）的干燥花。

醋酸地塞米松片（陽性對照，浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：151238，規格：0.75 mg）;注射用鹽酸博來霉素（瀚暉制藥有限公司，批號：16032311，規格：1.5萬單位）;兔源α-SMA抗體（批號：AG02247616）、兔源VE-cadherin抗體（批號：AC03185478）、兔源CD31抗體（批號：AO04265948）、兔源FSP1抗體（批號：AC09223656）均購自北京博奧森生物技術有限公司;兔源Notch4抗體（批號：GR288351-4）、山羊源DLL4抗體（批號：GR162316-12）均購自英國Abcam公司;山羊抗兔辣根過氧化酶（HRP）標記二抗（批號：3825j63）、兔抗山羊HRP標記二抗（批號：34q9532）、山羊抗小鼠HRP標記二抗（批號：1292k61）、小鼠源β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號：48k2671）均購自美國Affinity Biosciences公司;RIPA裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液均購自碧云天生物技術有限公司;0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）、牛血清白蛋白、二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司;ECL發光液、聚偏氟乙烯（PVDF）膜均購自默克密理博（中國）有限公司;其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 動物

SPF級健康SD大鼠48只，雄性，2月齡，體質量180～200 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產合格證號：SCXK（湘）2014-0011。

2 方法

2.1 補陽還五湯藥液的制備

按補陽還五湯的配方比例（生黃芪120 g、當歸6 g、赤芍5 g、地龍3 g、川芎3 g、桃仁3 g、紅花3 g）稱取各飲片適量，用10倍量（mL/g）水浸泡30 min后，文火煎煮2次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮，分別制得質量濃度分別為1.5、3、6 g/mL（以生藥總質量計）的藥液，于4 ℃保存，備用。

2.2 分組、造模與給藥

所有大鼠均適應性喂養7 d后，隨機分為正常組、模型組、地塞米松組和補陽還五湯低、中、高劑量組，每組8只。除正常組外，其余各組大鼠均于氣管內注射博來霉素以復制IPF模型：大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，行頸正中切口，分離、暴露氣管，經氣管軟骨環間隙向心端穿刺，注射博來霉素0.5萬單位/kg（以生理鹽水為溶劑），隨后立即將大鼠直立并旋轉，使藥液在肺內分布充分、均勻，縫合傷口。正常組大鼠經氣管軟骨環間隙注入等容生理鹽水，其余操作同上。術后，所有大鼠均自由飲水、進食。自造模后第2天起，正常組和模型組大鼠均灌胃水[10 mL/（kg·d）]，地塞米松組大鼠灌胃地塞米松0.405 mg/（kg·d）（以水為溶劑，劑量設置參考人等效劑量并按動物體表面積換算而得），補陽還五湯低、中、高劑量組分別灌胃補陽還五湯6.435、12.87、25.74 g/（kg·d）（以生藥總質量計，由“2.1”項下藥液經水稀釋制得;劑量設置參考人等效劑量并按動物體表面積換算而得，其中中劑量與人等效劑量相當，每日1次，連續28 d。

2.3 標本采集

末次給藥24 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，于其股動脈放血后剖取兩肺，剪除氣管、支氣管，取左肺組織適量，備用。

2.4 肺組織中內皮細胞、間質細胞標志物表達情況檢測

采用免疫組化法檢測。取“2.3”項下大鼠肺組織適量，用-20 ℃氯化鈉溶液清洗3次，濾紙吸干水分，于4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，常規石蠟包埋、切片（厚度約為5 μm），置于60 ℃干燥箱中烘干2 h。切片經二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水后，用3%H2O2溶液室溫孵育10～15 min，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）清洗5 min×3次后，置于0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中，95 ℃微波加熱10 min，進行抗原熱修復;冷卻至室溫，用PBS清洗5 min×3次，用牛血清白蛋白于37 ℃封閉30 min;分別滴加CD31、VE-cadherin、α-SMA、FSP-1一抗（稀釋度均為1 ∶ 200），于37 ℃孵育2 h;用PBS清洗5 min×3次，滴加山羊抗兔HRP標記二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），室溫孵育30 min;用PBS清洗5 min×3次，經DAB顯色試劑盒顯色后，行常規乙醇梯度脫水、二甲苯透明、樹膠封片;在光學顯微鏡高倍鏡視野（×200）下隨機選取5個視野觀察，采用Image Pro Plus 6.0軟件測量并記錄每個視野中陽性染色（即染色后呈棕黃色的細胞）的平均光密度值，以此表示相應蛋白的表達水平。

2.5 肺組織中Notch4、DLL4表達情況檢測

采用蛋白質印跡法檢測。取“2.3”項下大鼠肺組織100 mg，加入4 ℃預冷的RIPA裂解液1 mL，勻漿，于4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，收集上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，加入等體積2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后，于95 ℃水浴中變性5 min后，于-80 ℃保存，備測。取上述蛋白適量進行SDS-PAGE電泳（電壓：100 V，時間：1.5 h），電泳結束后轉移至PVDF膜后，于5%脫脂奶粉中室溫振搖封閉1 h;分別加入Notch4、DLL4、β-actin一抗（稀釋度分別為 1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 500、1 ∶ 5 000），4 ℃孵育過夜，用TBST溶液清洗8 min×3次，分別滴加山羊抗兔HRP;標記二抗、兔抗山羊HRP標記二抗、山羊抗小鼠HRP標記二抗（稀釋度均為1 ∶ 10 000），37 ℃孵育1 h;用TBST溶液清洗8 min×3次，經ECL顯色后，置于化學凝膠成像系統中顯影;采用ImageJ 1.51K軟件進行分析，以目的蛋白與內參β-actin的灰度值比值表示相應蛋白的表達水平。

2.6 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD法。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 補陽還五湯對IPF模型大鼠肺組織中內皮細胞、間質細胞標志物表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺組織中CD31、VE-cadherin的表達水平均顯著降低，α-SMA、FSP-1的表達水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠肺組織中CD31、VE-cadherin的表達水平均顯著升高，α-SMA、FSP-1的表達水平均顯著降低;與地塞米松組比較，補陽還五湯低劑量組的CD31、VE-cadherin表達水平均顯著降低，α-SMA、FSP-1的表達水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）;其余各給藥組上述指標組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05），詳見圖1、表1。

3.2 補陽還五湯對IPF模型大鼠肺組織Notch4、DLL4表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺組織中Notch4、DLL4的表達水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.01）。各給藥組大鼠肺組織中Notch4、DLL4的表達水平均顯著低于模型組，補陽還五湯低劑量組上述指標顯著高于地塞米松組，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）;其余各給藥組上述指標組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05），詳見圖2、表2。

4 討論

IPF是一種纖維化間質性肺炎，其病因尚未完全明確。該病的臨床治療應分階段進行，其中輕、中度患者應以口服抗纖維化藥物為主;而病情嚴重者則需進行肺移植，平均存活時間僅為2～5年[12]。

有研究表明，IPF的主要病理改變是肺泡上皮損傷后的異常修復，即肺成纖維細胞的增殖活化和由此而產生的細胞外基質的過度沉積[2]。近來有研究證實，纖維化疾病中活化的肌成纖維細胞的另一個來源是內皮細胞[13]。雖然肌成纖維細胞是纖維化疾病中關鍵的細胞成分，但有研究指出，從內皮細胞向肌成纖維細胞的轉化并不需要完全的轉分化即可引發病理性纖維化的發生[14]。在這一過程中，內皮細胞將獲得間質細胞表型，繼而表達α-SMA、FSP-1等間質細胞標志物，同時CD31、VE-cadherin等內皮細胞標志物表達則明顯下調[4，15]。其中，CD31是內皮細胞存在的重要標志，可顯示較小的微血管內皮細胞的生成情況[16];VE-cadherin是調節微血管內皮細胞黏附、連接的重要蛋白，當肺纖維化損傷發生時，其可迅速磷酸化，繼而引起內皮細胞間黏附作用失調，最終導致微血管屏障受損[17];α-SMA是成纖維細胞的特異性標志物，其表達水平的高低可用以評估肌纖維母細胞的轉化程度[18];FSP-1作為肺成纖維細胞的標志物之一，在正常肺組織中表達較少，而在博來霉素誘導的IPF中呈持續升高，可作為研究該病發病機制的指標之一[19]。

Notch信號通路（包括DLL4/Notch4等）是一種高度保守的信號傳導途徑，參與了肺細胞生物功能的調節，與IPF關系密切，已有證據表明該信號通路可影響內皮細胞的增殖、遷移及分化，在EndMT過程中發揮了重要作用[5-6，20-21]。在TGF-β誘導的人臍靜脈內皮細胞轉分化中，整合素avβ3可激活Notch信號通路，活化FSP-1編碼基因啟動子，使其蛋白表達增強，從而使內皮細胞獲得平滑肌細胞樣的特征，大大增強了細胞的遷移能力;阻斷Notch信號通路后，內皮細胞CD31表達下調，α-SMA表達上調，EndMT受到抑制[22-23]。Notch4特異性分布于血管內皮細胞中，為血管內皮細胞的特異性受體，在血管發育的后期參與調節血管的形成，抑制晚期血管的分支發育[24]。DLL4是Notch信號通路的重要配體之一，特異性表達于內皮細胞中，可通過參與動靜脈分化、誘導血管尖細胞來控制細胞數目、血管分支數和血管密度，從而在血管構建和穩態維護中發揮重要作用[25]。有研究發現，當大鼠發生IPF時，其體內的DLL4/Notch4信號通路被激活，從而導致肺組織內血管新生和重構明顯失控，是IPF發生和進展的重要通路之一[20]。

中醫將IPF歸于“肺痹”“肺痿”等癥范疇。在該病的早期階段多因外邪阻絡、氣血凝滯致肺絡閉阻，多歸于“肺痹”范疇;在該病的后期因出現肺氣虧虛、肺臟失去津液濡養致肺葉萎縮，則多歸于“肺痿”范疇[26]。補陽還五湯首載于清代的《醫林改錯》，該方中黃芪益氣活血化瘀，為君藥;當歸活血通絡，為臣藥;赤芍、桃仁、紅花、川芎協同當歸活血祛瘀通絡，地龍周行全身、通經活絡，共為佐藥;諸藥通補兼用，行益氣、活血、通絡之效，與IPF核心病機“氣虛血瘀，肺絡閉阻”一致，符合中醫“方-證要素對應”的治療原則[27]。近年來，補陽還五湯治療IPF的效果受到臨床認可，關于該方藥理作用的研究也逐漸深入?，F代藥理研究表明，補陽還五湯對實驗性IPF具有較好的防治作用，可通過改善微循環、抑制過敏介質釋放來延緩IPF的進程[28]。為此，本研究以療效較好的地塞米松[29]為陽性對照，在前期研究的基礎上探討了補陽還五湯對IPF模型大鼠肺組織中內皮細胞、間質細胞標志物表達以及DLL4/Notch4信號通路的影響。

本研究結果顯示，模型組大鼠肺組織中CD31、VE-cadherin的表達水平均較正常組顯著降低，α-SMA、FSP-1的表達水平均較正常組顯著升高，提示模型復制成功。給予不同劑量的補陽還五湯后，各給藥組大鼠CD31、VE-cadherin的表達水平均較模型組顯著升高，α-SMA、FSP-1的表達水平均顯著降低，表明補陽還五湯可不同程度地上調CD31、VE-cadherin的表達，下調α-SMA、FSP-1的表達，提示該方治療IPF的作用可能與抑制EndMT有關。進一步研究結果顯示，模型組大鼠肺組織中Notch4、DLL4的表達水平均顯著升高，提示IPF發生后，DLL4/Notch4信號通路被激活，血管內皮細胞分化增多，使得結構及功能完整的血管的形成受到抑制，造成肺纖維化進一步加重。給予不同劑量的補陽還五湯后，大鼠Notch4、DLL4的表達水平均顯著降低，提示補陽還五湯治療IPF的機制可能與抑制DLL4/Notch4信號通路有關。此外，本研究結果還顯示，補陽還五湯低劑量組大鼠肺組織中CD31、VE-cadherin的表達水平顯著低于地塞米松組，α-SMA、FSP-1、Notch4、DLL4的表達水平均顯著高于地塞米松組，而中、高各劑量組與地塞米松組比較差異無統計學意義，提示中、高劑量補陽還五湯對IPF模型大鼠的改善作用與地塞米松相當。

綜上所述，補陽還五湯可通過干預EndMT來減輕模型大鼠的IPF，其機制可能與抑制DLL4/Notch4信號通路有關，但其具體靶點和機制有待后續研究進一步確認。

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（收稿日期：2019-01-18 修回日期：2019-07-12）

（編輯：張元媛）