刺山柑總生物堿對系統性硬皮病模型小鼠Notch通路的影響

李偉 盧軍 阿依提拉麥麥提江 康小龍

中圖分類號 R965.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）23-3205-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.23.07

摘 要 目的：研究刺山柑總生物堿對系統性硬皮病（SSc）模型小鼠Notch通路相關蛋白Notch2、Delta-like 3（DLL3）、Jagged1和Notch胞內段1（NICD1）的影響。方法：將BALB/c小鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組（青霉胺125 mg/kg）和刺山柑總生物堿低、中、高劑量組（225、450、900 mg/kg），每組16只。除空白對照組外，其余各組小鼠皮下注射博來霉素4周復制SSc模型，刺山柑總生物堿各劑量組小鼠外敷相應劑量的刺山柑總生物堿乳膏，陽性對照組小鼠灌胃相應劑量的青霉胺，空白對照組和模型組小鼠外敷不含藥的乳膏基質，每天1次，連續給藥8周。末次給藥后4 h，取各組小鼠給藥區皮膚，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）法檢測皮膚組織中Notch2、NICD1 mRNA表達，酶聯免疫吸附法測定皮膚組織中DLL3含量，免疫組化法檢測皮膚組織中Jagged1蛋白表達。結果：與空白對照組比較，模型組小鼠皮膚組織中Notch2、NICD1 mRNA及DLL3含量、Jagged1蛋白表達均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，刺山柑總生物堿中、高劑量組和陽性對照組小鼠皮膚組織中NICD1 mRNA、DLL3含量、Jagged1蛋白表達均顯著降低，刺山柑總生物堿高劑量組和陽性對照組小鼠皮膚組織中Notch2 mRNA表達顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。結論：刺山柑總生物堿可抑制SSc模型小鼠皮膚組織中Notch2、NICD1、DLL3及Jagged1的異常表達，對SSc模型小鼠Notch通路的過度激活有一定的抑制作用。

關鍵詞 刺山柑總生物堿;系統性硬皮病;Notch2;Notch胞內段1;Delta-like 3;Jagged1;小鼠

Effects of Capparis spinosa Total Alkaloid on Notch Pathway in Mice with Systemic Sclerosis

LI Wei，LU Jun，Ayitila·Maimaitijiang，KANG Xiaolong（Dept. of Pharmacy， TCM Hospital of Affiliated to Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effects of Capparis spinosa total alkaloid on Notch pathways related protein Notch2， Delta-like 3 （DLL3）， Jagged1 and Notch intracellular domain 1 （NICD1） in mice with systemic sclerosis （SSc）. METHODS： BALB/c mice were randomly divided into blank control group， model group， positive control group （penicillamine 125 mg/kg）， C. spinosa total alkaloid low-dose， medium-dose and high-dose groups （225， 450， 900 mg/kg）， with 16 mice in each group. Except for blank control group， other groups were given bleomycin subcutaneously for 4 weeks to induce SSc model. C. spinosa total alkaloid groups were given relevant dose of C. spinosa total alkaloid cream for external use. Positive control group was given relevant dose of penicillamine intragastrically. Blank control group and model groups were given cream matrix without drug， once a day， for consecutive 8 weeks. 4 h after last administration， the skin of the administration area of each group of mice was collected. mRNA expression of Notch2 and NICD1 was detected by real-time PCR; the content of DLL3 was measured by ELISA; the protein expression of Jagged1 in skin tissue was detected by immunohistochemstry. RESULTS： Compared with blank control group， mRNA expression of Notch2 and NICD1， DLL3 content， protein expression of Jagged1 were markedly increased， with statistical significance （P<0.01）. Compared with model group， mRNA expression of NICD1， DLL3 content and protein expression of Jagged1 were decreased significantly in C. spinosa total alkaloid medium-dose and high-dose groups， positive control group， mRNA expression of Notch2 in skin tissue were decreased significantly in C. spinosa total alkaloid high-dose group and positive control group， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： C. spinosa total alkaloid can inhibit the abnormal expression of Notch2， NICD1， DLL3 and Jagged1 in skin tissue of SSc model mice， and inhibit over activation of Notch pathway in SSc model mice.

KEYWORDS ? Capparis spinosa total alkaloid; Systemic sclerosis; Notch2; Notch intracellular domain 1; Delta-like 3; Jagged1; Mice

系統性硬皮病（Systemic sclerosis，SSc）病理表現為多組織、多器官纖維化，免疫系統失衡及血管異常[1]。刺山柑（Capparis spinosa L.）為白花菜科（Capparaceae）山柑屬（Capparis Toum. ex L.）植物，系新疆道地藥材之一。其性味辛苦溫，具有祛風散寒、除濕、消腫止痛、擴張血管的功效。有研究表明，SSc患者Ⅰ型膠原的合成及成纖維細胞增殖可被刺山柑乙醇提取物抑制[2];硬皮病模型小鼠的膠原沉積、真皮增厚等病理改變可被刺山柑流浸膏抑制[3];刺山柑乙酸乙酯和乙醇提取物能抑制硬皮病模型小鼠真皮增厚及Ⅰ型膠原、轉化生長因子β1過表達[4]。刺山柑總生物堿系本課題組從刺山柑中提取的有效部位，前期研究表明，給SSc模型小鼠外用刺山柑總生物堿乳膏后，小鼠皮膚纖維化等病理改變得到改善[5]，增厚的真皮鱗狀上皮變薄，并可下調皮膚組織中羥脯氨酸及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達[6-7]，提示刺山柑總生物堿可抑制SSc的膠原合成、改善組織纖維化。刺山柑總生物堿乳膏已于2010年獲得醫院制劑批準文號：20050024HZ。本文以博來霉素復制SSc模型小鼠，研究刺山柑總生物堿對SSc模型小鼠皮膚組織纖維化密切相關的Notch通路相關蛋白Notch2、Delta-like 3（DLL3）、Jagged1和Notch胞內段1（NICD1）表達的影響，以為探討刺山柑總生物堿改善SSc組織纖維化的作用機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Multiskan Spectrum酶標儀、Multifuge X1R低溫離心機（美國Thermo Fisher公司）;DFC360 FX顯微鏡、RM2245切片機（德國Leica公司）;C1000 Thermal Cycler實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

刺山柑原藥材由新疆麥迪森維藥飲片廠提供，由新疆藥物研究所何江研究員鑒別為真品;注射用鹽酸博來霉素（浙江海正輝瑞制藥有限公司，批號：17001711，規格：15 mg）;青霉胺片（上海上藥信誼藥廠，批號：052160901，規格：0.125 g）;兔抗小鼠Jagged1抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國Cell Signaling Technology公司）;免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）;高純總RNA快速提取試劑盒、SYBR real-time PCR試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）;小鼠DLL3酶聯免疫試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）;二喹啉甲酸法（BCA法）蛋白定量試劑盒（江蘇碧云天生物技術有限公司）;小鼠qPCR的Notch2、NICD1和內參Rn18s特異性引物（上海生物工程股份有限公司合成）。

1.3 動物

BALB/c小鼠96只，♀，SPF級，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物公司，生產許可證號：SCXK（京）2016-0006。所有小鼠均在環境溫度（24±1） ℃、相對濕度45%～65%、光照時間12 h的環境中飼養1周后進行實驗，飼養期間小鼠自由進食標準飼料和飲水。本實驗方案通過新疆醫科大學附屬中醫醫院動物實驗倫理審查。

2 方法

2.1 刺山柑總生物堿提取物濃縮液的制備

將曬干粉碎的刺山柑果實，加10倍量95%乙醇80 ℃水浴回流提取30 min，提取2次，過濾，濾液備用，合并濾液，減壓濃縮至藥材與藥液質量比為2 ∶ 1。提取物濃縮干燥后經紫外分光光度法測得總生物堿含量占提取物的32%（m/m），高效液相色譜法測得鹽酸水蘇堿含量占提取物的2.2%（m/m）。

2.2 刺山柑總生物堿乳膏的制備

以單硬脂酸甘油酯、白凡士林、月桂氮 酮、硬脂酸為油相，水浴加熱至90 ℃使熔融;以刺山柑總生物堿提取物濃縮液與甘油混合物為水相，水浴加熱至90 ℃;將羥基苯甲酸乙酯、十二烷基硫酸鈉加入到適量水中，水浴加熱使溶解作為乳化劑;把油相、水相自水浴中取出，溫度降至85 ℃時，在油相中一邊加入水相和乳化劑一邊攪拌，直至乳化完全。該乳膏中刺山柑總生物堿的含量以鹽酸水蘇堿計，不得少于16 mg/g。

2.3 分組、造模與給藥

96只BALB/c小鼠，采用隨機數字表法分為空白對照組、模型組、陽性對照組（青霉胺125 mg/kg，根據臨床用藥量換算而得）[1，8]和刺山柑總生物堿低、中、高劑量組（225、450、900 mg/kg，分別為人臨床用量的4.5、9、18倍），每組16只。剃除各組小鼠背部被毛，除空白對照組背部皮下注射生理鹽水外，其余各組小鼠采用博來霉素皮下注射法[9-10]復制SSc模型，注射博來霉素30 μg/d，連續給藥30 d，當小鼠背部注射部位均出現皮膚增厚、彈性變差等變化以及隨機抽取各組1只小鼠，取皮膚組織做病理學檢查顯示出現炎癥及纖維化等病變時，即造模成功。造模成功后，刺山柑總生物堿各劑量組小鼠外敷225、450、900 mg/kg的刺山柑總生物堿乳膏，陽性對照組小鼠灌胃給予125 mg/kg的青霉胺，空白對照組和模型組小鼠外敷不含刺山柑總生物堿的乳膏基質，每天給藥1次，連續給藥8周。

2.4 qPCR法檢測皮膚組織中Notch2、NICD1 mRNA表達

末次給藥后4 h處死小鼠，每組取5只小鼠背部注射處皮膚，置于凍存管，液氮迅速冷凍10 min，-80 ℃保存。采用高純總RNA快速提取試劑盒提取皮膚組織總RNA，操作按試劑盒說明書進行，逆轉錄獲到cDNA，設計Notch2、NICD1特異性引物，以Rn18s為內參，進行qPCR。反應條件：94 ℃預變性2 min;94 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸95 s，35個循環;72 ℃最后延伸5 min。采用2-ΔΔct法分析Notch2、NICD1 mRNA的相對表達量，Δct=ct目標基因-ct內參基因，ΔΔct=Δct實驗組-Δct對照組。qPCR引物序列見表1。

2.5 酶聯免疫吸附法檢測皮膚組織中DLL3含量

取各組15只處死小鼠背部皮膚，加入生理鹽水，組織勻漿機研磨成組織勻漿，濃度為10%，4 000 r/min（離心半徑8.3 cm）離心10 min后提取上清液。按小鼠DLL3酶聯免疫試劑盒相關操作測定上清液中DLL3含量，并以每1 mL上清液中總蛋白含量（BCA法蛋白定量試劑盒測定）校正結果。

2.6 免疫組化法檢測皮膚組織中Jagged1蛋白表達

各組取5只處死小鼠的背部注射區皮膚，4%多聚甲醛中固定、脫水、包埋、切片，脫蠟，放入檸檬酸鈉液中，微波修復5 min，用3% H2O2封閉20 min，磷酸鹽緩沖液沖洗，加入兔抗小鼠Jagged1抗體（1 ∶ 100稀釋），4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗 ? ? ?（1 ∶ 100稀釋），室溫孵育1 h，二氨基聯苯胺法（DAB）染色，蘇木精復染。用顯微鏡攝片后輸入計算機，Image Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件對圖片進行分析，調整圖像分析軟件在相同條件下計算積分光密度（IOD）和組織面積（area），再按公式計算平均光密度（MOD），MOD=IOD/area。各實驗組MOD與空白對照組MOD的比值作為Jagged1的相對表達量。

2.7 統計學方法

采用 SPSS 11.0 軟件進行統計分析。采用方差分析各組差異，SNK-q法分析兩組間均數差異。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 皮膚組織中Notch2、NICD1 mRNA相對表達量比較

與空白對照組比較，模型組皮膚組織中Notch2、NICD1 mRNA相對表達量顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，刺山柑總生物堿高劑量組和陽性對照組小鼠皮膚組織中Notch2 mRNA相對表達量顯著降低，刺山柑總生物堿中、高劑量組和陽性對照組小鼠皮膚組織中NICD1 mRNA相對表達量顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。與陽性對照組比較，刺山柑總生物堿高劑量組小鼠皮膚組織中Notch2、NICD1 mRNA相對表達量無明顯變化（P>0.05）。各組小鼠皮膚組織中Notch2、NICD1 mRNA相對表達量的結果見圖1。

3.2 皮膚組織中DLL3含量比較

與空白對照組比較，模型組皮膚組織中DLL3含量顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，刺山柑總生物堿低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠皮膚組織中DLL3含量顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。與陽性對照組比較，刺山柑總生物堿中、高劑量組小鼠皮膚組織中DLL3含量無明顯變化（P>0.05）。各組小鼠皮膚組織中DLL3含量測定結果見表2。

3.3 皮膚組織中Jagged1蛋白相對表達量比較

與空白對照組比較，模型組皮膚組織中Jagged1蛋白相對表達量顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，刺山柑總生物堿中、高劑量組和陽性對照組小鼠皮膚組織中Jagged1蛋白相對表達量顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。與陽性對照組比較，刺山柑總生物堿高劑量組小鼠皮膚組織中Jagged1蛋白相對表達量無明顯變化（P>0.05）。各組小鼠皮膚組織中Jagged1蛋白表達的免疫組化圖見圖2，相對表達量的結果見圖3。

4 討論

SSc是一種多組織呈現慢性炎癥和纖維化的自身免疫性疾病，目前認為SSc病因是由于成纖維細胞活化，合成膠原、纖維連接蛋白等增多，造成細胞外基質沉積，引發組織纖維化[11-12]。目前，SSc的治療缺乏明確有效的藥物，多以免疫抑制、抗纖維化及對癥治療為主，青霉胺是目前臨床上治療系統性硬皮病較經典和常用的藥物[1，8]，故本文選擇青霉胺做為陽性對照藥物。

Notch信號通路是一種進化上高度保守，廣泛存在于多種組織細胞中的，對細胞的生長、發育、凋亡等發揮重要作用的信號通路[13]。Notch信號通路的異常激活參與了多種器官纖維化疾病，調節Notch信號通路可能對治療纖維化疾病有一定作用[14]。哺乳動物Notch信號的受體有4種，分別是Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，而Notch的配體蛋白共有5種，分別是Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4[15]。Notch受體與配體相互作用而激活，兩者的結合導致受體構象發生改變，在解整合素金屬蛋白酶（ADAM）蛋白酶的作用下，釋放出NICD，NICD發生核轉位，可激活影響細胞的分化、增殖和凋亡的基因如Hes和Hey等的轉錄[16-17]。

有研究提示，Notch信號通路參與了SSc纖維化的形成，發生纖維化的SSc患者皮膚組織和成纖維細胞的Notch通路被激活，Notch配體Jagged1過表達及NICD蓄積，可以導致SSc患者皮膚組織的纖維化，并可引起免疫功能紊亂和自身抗體的失衡[18-19];用次氯酸、博來霉素誘導的SSc模型鼠及緊皮鼠（Tsk-1鼠）皮膚和肺組織也發現了NICD表達增高[18];用Notch SiRNA抑制Notch表達可改善SSc小鼠皮膚增厚和纖維化[20]。Notch信號通路與SSc成纖維細胞活化相關，用重組的Jagged1可以刺激SSc成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，表達高水平的α-平滑肌肌動蛋白，產生大量的膠原和細胞外基質[19]。本研究結果發現，模型組小鼠皮膚組織中Notch2、NICD1 mRNA和DLL3含量、Jagged1蛋白表達升高，提示SSc模型小鼠存在Notch通路的異常激活;450、900 mg/kg的刺山柑總生物堿可明顯降低Notch2、NICD1 mRNA和DLL3含量、Jagged1蛋白表達，提示刺山柑總生物堿可抑制Notch受體與配體的相互作用，抑制NICD蓄積及核轉位，對SSc小鼠Notch通路的異常激活有一定抑制作用。