化學原料藥結構確證的常見分析方法及應用

劉忠洪 李鵬熙

摘 要：化學原料藥的結構確證是藥物研發的基礎。文中主要介紹結構確證的常用分析方法，包括元素分析（elemental analysis）、可見-紫外吸收光譜（ultraviolet and visible absorption spectra，UV）、紅外吸收光譜（infrared absorption spectrum，IR）、核磁共振譜（nuclear magnetic resonance，NMR）、質譜（mass spectrometry，MS）、X-衍射（X-ray diffraction， XRD）、熱分析（Thermal analysis，TA）等，并結合其應用加以討論。

關鍵詞：原料藥;結構確證;分析方法

根據《化學藥物原料藥制備和結構確證研究的技術指導原則》[1]，原料藥的結構確證是藥物研發的基礎，是保證藥學其它方面研究、藥理毒理和臨床研究能否順利進行的決定性因素。進行結構確證時，首先應根據化合物的結構特征制訂科學、合理、可行的研究方案，并制備符合研究要求的樣品，再進行有關的結構確證分析研究，最后對研究結果進行綜合解析，確證測試品的結構。

通過結構確證，可以明確藥物分子的平面骨架結構，即各原子的連接順序和方式;明確藥物分子的空間構型;確定藥物中的結晶水或結晶溶劑含量;明確藥物的晶型，即分子在晶體中的排列方式。通過與對照品進行對比，可綜合分析原料藥樣品與對照品是否結構一致。

目前，常用的研究分析方法主要包括元素分析、可見-紫外吸收光譜、紅外吸收光譜、核磁共振譜、質譜、X-衍射、熱分析等[2]。本綜述就以上常見的分析方法及其應用進行總結和討論。

1.元素分析

通常采用元素分析法，對原料藥中存在的元素種類進行鑒定，并獲得其含量。分析方法可分為經典化學分析和儀器分析兩類。前者主要采用化學方法達到分析目的，后者主要采用化學和物理方法獲取結果，這類分析方法往往需要應用特定的儀器，靈敏度高，操作簡便快速，發展迅速，但是經典的化學分析方法仍有其重要意義。

對于因藥物自身結構特征而難于進行元素分析時，在保證高純度情況下可采用高分辨質譜方法獲得藥物元素組成相關信息[3]。

2. 可見-紫外吸收光譜

采用可見-紫外吸收光譜法，在不同波長處吸光度的測定和吸收系數（特別是摩爾吸收系數）的計算，以及對主要吸收譜帶的歸屬分析（如K 帶、R 帶、E 帶、B 帶），獲得原料藥結構中可能含有的發色團、助色團種類以及可能的連接方式等結構信息。當發色團上存在酸性或堿性基團，則需在酸或堿溶液中（常用0.1mol/L HCl 或0.1mol/L NaOH）測試最大吸收波長，觀察其紫移或紅移現象，進一步分析酸性或堿性基團的存在[4]。另外，采用紫外吸收光譜可檢驗具有大共軛體系或發色官能團的化合物，作為其他鑒定方法的補充。

3. 紅外吸收光譜

有時原料藥在紫外波長范圍內沒有吸收或者吸收微弱，或紫外吸收光譜特征性不強，可采用紅外吸收光譜進行分析。紅外吸收光譜是利用一束不同波長的紅外射線照射到物質的分子上，分子中某個振動頻率與紅外光的某一頻率相同時，分子就吸收此頻率光發生振動能級躍遷，形成特殊的光譜。

此法可明確各原子的連接順序和方式，推測出藥物中可能存在的化學鍵、所含的官能團及其初步的連接方式[5]，亦可給出藥物的幾何構型、晶型、立體構象等信息。紅外吸收光譜具有高度特征性，可與對照品紅外吸收光譜進行對比分析鑒定。已有匯集成冊的標準紅外光譜集出版，可將這些圖譜貯存在計算機中，用以對比和檢索，進行分析鑒定。

4.核磁共振譜

在外磁場的作用下，具有磁矩的原子核存在著不同能級，當用一定頻率的射頻照射分子時，可引起原子核自旋能級的躍遷，即產生核磁共振。目前應用最多的是氫核磁共振譜（簡稱氫譜，1H-NMR）和碳核磁共振譜（簡稱碳譜，13C-NMR），此外還有二維核磁共振譜，包括H-Hcosy（氫-氫相關譜）、HMBC （碳-氫遠程相關譜）、HMQC （碳-氫相關譜）、NOESY（氫-氫化學位移交換譜）等。氫譜主要提供質子類型及其化學環境、氫分布、核間關系，但不能給出不含氫基團的共振信號，難以鑒別化學環境近似的烷烴，且經常出現譜線重疊。碳-13核磁共振譜可給出豐富的碳骨架及有關結構和分子運動的信息，如分子中含有多少個碳原子，它們各屬于哪些基團，可以區別伯、仲、叔、季碳原子等。所以氫譜和碳譜互為補充。

采用核磁共振可獲得原料藥某些元素在分子中的類型、數目、相互連接方式、周圍化學環境、甚至空間排列構型、結晶水/結晶溶劑等信息，并推測出化合物相應官能團的連接狀況及其初步的結構[6]。

5. 質譜

質譜是利用多種離子化技術，將物質分子轉化為離子，按其質荷比（m/z）的差異分離測定，進行物質成分和結構分析的方法。其應用范圍廣，不受原料藥物態限制，且靈敏度高、分析速度快、信息直觀、解析方便易行。

質譜分析中，由高分辨質譜獲得分子離子峰的質量數，可分析得到原料藥的精確相對分子質量;從分子離子峰和碎片離子峰的信息可推測原料藥化合物的裂解方式及其分子結構關系;通過同位素峰強比及其分布特征可推算分子中Cl、Br、S等原子數;還可與色譜聯用（GC-MS、LC-MS）或質譜聯用（MS-MS），為分離、鑒別和定量測定原料藥，提供滿足結構確證的樣品。

6.X-衍射

X-射線衍射方法是研究晶體最有效的工具，對原料藥晶型的研究非常理想。常用的方法包括粉末X-衍射（XRPD）和單晶X-衍射（XRSD）。

粉末X-衍射是判斷原料藥晶型的首選方法，可用于固態單一化合物的鑒別與晶型確定、晶態與非晶態物質的判斷，亦可用于原料藥（晶型）的穩定性研究。

單晶X-衍射可獲得原料藥的相對或絕對構型、藥物晶型以及原料藥中結晶水/結晶溶劑及含量等一系列信息。對于手性原料藥結構分析，采用普通的單晶X-衍射不能區分對映體，僅能推導出在空間的相對位置和藥物的相對構型。

7.熱分析

熱分析法是在程序控制溫度下，研究物質隨溫度的變化，發生的晶型轉化、熔融、蒸發、脫水等物理變化，或熱分解、氧化還原等化學變化，以及伴隨發生的溫度、能量或重量改變。

最常用的熱分析方法有差示熱分析（DTA）、熱重分析（TGA）、導數熱重量法（DTG）、差示掃描量熱法（DSC）、熱機械分析（TMA）和動態熱機械分析（DMA）。采用熱分析法處理原料藥，可反映原料藥的晶型、結晶水/結晶溶劑、物相轉化、相容性、熱分解和穩定性等信息[7]。

除上述七種常用的結構確證分析方法外，根據原料藥結構特征，還可用其他方法加以輔助支持。例如，采用熔點法和光學顯微鏡法，測定原料藥晶型;采用比旋度、圓二色譜推導手性原料藥的絕對構型，采用旋光光譜推導相對構型;干燥失重、水分測定獲得原料藥中的結晶水或結晶溶劑、吸附水或溶劑的含量;結構中含有金屬離子以及F、P 等元素的藥物，可進行相應金屬原子吸收以及F、P 等元素的測定。原料藥為多肽，可采用氨基酸分析、質譜、序列分析以及肽圖測繪、紫外、紅外、核磁共振、多種流動相HPLC、比旋度測定等獲得合成多肽的結構信息。

最后將每一種結構確證方法提供的信息進行綜合且全面的解析，遵循簡明扼要、有機、合理、深入的原則，才能得到原料藥完整的結構情況，為原料藥后續的研究和應用提供有力可靠的支持。

參考文獻

[1] 《化學藥物原料藥制備和結構確證研究的技術指導原則》，2005

[2] 寧黎麗.化學原料藥結構確證的研究思路和方法[J] 中國新藥雜志，2008，17（18）：1637-1639.

[3] 朱希，高浩凌，范鋼，盛力，沈大冬.頭孢妥侖匹酯有關物質的合成及其結構確證[J].中國抗生素雜志，2019，44（1）：83-87.

[4] 張明光，馮小虎，于水濤，吉小龍，陳再新.鹽酸貝西沙星的波譜學數據與結構確證[J].波譜學雜志，2018，35（3）：374-384.

[5] 余大海，康旺，郝福，李志剛.卡巴他賽結構確證的波譜學研究[J].波譜學雜志，2017，34（2）：191-199.

[6] 林云良，高紅梅，李鋒，陳相峰.盧立康唑的波譜學特征和結構確證[J].波譜學雜志，2018，35（3）：385-392.

[7] 董曉亞，雷勇勝，傅琳，楊忠峰，蔣慶峰.伊曲康唑的特性鑒定[J].現代儀器與醫療，2016，22（6）：87-90.