七味白術散對輪狀病毒感染乳鼠小腸iEL CD3+T細胞核內(nèi)抗病毒蛋白表達的影響

左勝男 伍參榮 陳超龍 劉碧源 申可佳 譚曉鳳 蔡銳 李珊

〔摘要〕 目的 探討七味白術散對輪狀病毒（human rotarirus， HRV）感染乳鼠小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞（iEL） CD3+T細胞核內(nèi)抗病毒蛋白表達的影響，進一步闡明該方抗HRV機制。方法 選取5日齡NIH乳鼠168只，隨機分為7組，正常對照組（N組）常規(guī)喂養(yǎng)，其余各組建立HRV腹瀉模型，并分別灌服生理鹽水（M組）、七味白術散（B組）、病毒唑（Z組）、抑制劑（Y組）、七味白術散加抑制劑（BY組），病毒唑加抑制劑（ZY組）;分別于用藥后32、40、48 h取各組乳鼠小腸黏膜，采用Western blotting方法測定小腸iEL CD3+T細胞核中雙鏈RVA依賴的蛋白質(zhì)激酶（PKR）、真核翻譯起始子2的α亞基（eIF-2α）、2'，5'-寡腺苷酸合成酶（OAS），RNA酶L（RNaseL）蛋白的表達。結果 B組乳鼠小腸粘膜iEL胞核中PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL蛋白表達48 h時明顯高于N組、M組、Y組、BY組、ZY組以及Z組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 七味白術散能促進感染乳鼠小腸黏膜iEL CD3+T細胞核中抗病毒蛋白PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL的表達，從而實現(xiàn)對HRV的清除作用。

〔關鍵詞〕 七味白術散;輪狀病毒;抗病毒蛋白;PKR; eIF-2α

〔中圖分類號〕R289.3? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.007

輪狀病毒（human rotavirus， HRV）是導致5歲以下嬰幼兒急性腹瀉和死亡的重要病原體，全世界每年大約50萬兒童死于該疾病[1]，如何防治輪狀病毒感染性腹瀉也成為當前醫(yī)學研究的熱點。目前對于輪狀病毒腸炎尚無特效治療藥物[2]，中藥復方七味白術散（人參、白術、茯苓、甘草、葛根、藿香、木香）源自宋朝錢乙《小兒藥證直訣》，是治療小兒腹瀉的經(jīng)典方劑[3]。臨床和實驗研究均表明，其對輪狀病毒引起的腹瀉有很好的治療作用[4-9]。

抗病毒蛋白（AVP）是由干擾素（IFN）通過JAK/STAT信號轉導途徑與相應的受體結合，激活信號級聯(lián)反應誘導產(chǎn)生的。AVP包括雙鏈RNA依賴的蛋白激酶（PKR）、2'，5'-寡腺苷酸合成酶（OAS）、Mx蛋白等。其中最主要的是PKR和OAS：活化的PKR作用于真核細胞翻譯起始子2的α亞基（eIF-2α），使之磷酸化，從而使病毒肽鏈的合成受阻[10-13];OAS能夠活化RNA酶L（RNaseL），降解病毒mRNA[14]。

前期研究已經(jīng)從基因表達的水平證實了七味白術散能增強HRV感染乳鼠小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞（iEL）IFN-γ及IFN-γR mRNA表達水平，本實驗通過觀察其對HRV感染乳鼠小腸iEL CD3+T細胞核內(nèi)AVP表達的影響，進一步為該藥治療HRV感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

取5日C57BL/6乳鼠168只，由湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學實驗動物中心集體購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SYXK（湘）2013-0005。小鼠購回后置消毒鼠盒中飼養(yǎng)，消毒牛奶人工喂養(yǎng)，保持室溫20～25 ℃。

1.2? 藥物

七味白術散（組成：人參7.5 g，白術15 g，茯苓15 g，葛根15 g，藿香15 g，木香6 g，甘草3 g）藥材均購自湖南中醫(yī)學院中醫(yī)門診部醫(yī)林藥號。用自來水-單蒸水-雙蒸水分別洗3次，放入三角瓶中，加4倍體積的三蒸水浸泡2 h（人參另泡另煎），煎2次，每次煎30 min。去渣，兩煎液混合，G4濾器過濾，于60 ℃水浴中濃縮成每毫升含原生藥1 g的藥液，密封，隔水煮沸消毒;病毒唑，天津藥業(yè)焦作有限公司，批號：10060112，給藥前用生理鹽水稀釋成1.4 mg/mL;蛋白酪氨酸激酶抑制劑Genistein：給藥前用DMSO溶解后用生理鹽水稀釋成5 mg/mL。

1.3? 細胞與病毒

MA104細胞，人輪狀病毒 HRV（Wa株）由中國科學院預防醫(yī)學中心段昭軍教授贈送。MA104細胞主要用于HRV（Wa株）擴增，擴增后的病毒保存于液氮，供實驗造模用。

1.4? 試劑及儀器

HRV抗原ELISA試劑盒（武漢博士德公司）; NE-PER胞質(zhì)胞核提取試劑盒（美國PIERCE公司）;蛋白定量試劑盒（Thermo，USA.）;兔抗小鼠PKR、eIF-2α和羊抗小鼠OAS、 RNaseL（Santa Cruz公司）;小鼠β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的相應二抗（羊抗兔IgG、兔抗羊IgG）（康為公司），ECL顯色液。凝膠電泳儀（DYY-Ⅲ型，北京六一儀器廠），轉移電泳槽（VE-186，上海天能）。

1.5? HRV感染乳鼠模型的制備與分組

將168只乳鼠隨機抽出24只乳鼠作為正常對照組（N組），其余乳鼠參照文獻[8]經(jīng)口感染，50 μl/只（濃度100TCID50/100 μL）HRV懸液，N組乳鼠滴入等量細胞生長維持液。HRV感染24 h后，造模組乳鼠均出現(xiàn)不同程度的腹瀉，肛周有大便污染痕跡。收集乳鼠糞便，用鼠輪狀病毒抗原ELISA試劑盒（上海一基實業(yè)有限公司產(chǎn)品）檢測糞便中HRV抗原，擬確定造模成功。

造模成功后的乳鼠，再按隨機數(shù)字法，將造模成功的乳鼠分為 HRV腹瀉模型，并分別灌服生理鹽水（M組）、七味白術散（B組）、病毒唑（Z組）、抑制劑（Y組）、七味白術散加抑制劑（BY組）、病毒唑加抑制劑（ZY組），每組24只，加上N組（給予生理鹽水）共7組，分別于造模給藥后的32、40、48 h處死乳鼠取小腸組織以及小腸淋巴細胞檢測抗病毒蛋白。每個時間段檢測分析8只乳鼠。

1.6? 標本采集

分別在給藥后32、40、48 h 3個時間點斷頭處死各組乳鼠后，立即取出回盲部至幽門的全部小腸，剝離去除腸系膜和脂肪組織，用Hanks液漂洗。

1.7? CD3+T淋巴細胞的分離

按文獻[15]方法將小腸經(jīng)Hanks液漂洗后，切成1 cm的片段，加入15 mL含2% FCS的RPMI-1640液，置37 ℃水浴震蕩30 min，取出后再用力震蕩15 s，靜置2 min，待腸片下沉，收集所有液體，用150目鋼網(wǎng)過濾2次，收集濾液，將濾液裝入事先制好的尼龍毛柱中流過，收集所有濾過的液體，濃縮制成2×107個/mL的單細胞懸液，將此單細胞懸液于4 ℃ 80×g離心5 min以去除雜質(zhì)，再經(jīng)45%和70% Percoll制成的梯度分離液離心90×g，25 ℃ 20 min，收集45%與70%界面層細胞，用含5% FCS的RPMI-1640洗3次，過免疫磁珠，分離出CD3+T淋巴細胞，備用。

1.8? Western blotting方法測定PKR、eIF-2α、OAS， RNaseL蛋白含量

操作步驟：（1）按試劑盒說明抽提CD3+T淋巴細胞胞核中的蛋白質(zhì);（2）按試劑盒的說明對抽提出的胞核蛋白定量;（3）配制12%分離膠，4%的濃縮膠，上樣，120V下電泳2 h，至溴酚蘭遷移到分離膠底部;（4）轉膜，60V轉移2 h;（5）5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，加入相應的一抗（抗PKR多抗1∶500，抗eIF-2α多抗1∶500，抗OAS多抗1∶500，抗RNaseL多抗1∶500）室溫孵育2 h，TBS洗3次，加入二抗（羊抗兔IgG、兔抗羊IgG，用量1∶500）室溫2 h，TBS洗3次;（6）DAB室溫顯色1～5 min，儀器掃描保存結果;（7）用凝膠圖像分析軟件Gel-Pro analyzer 4.0對目標帶的分子量和凈光密度值進行分析，以β-actin作為內(nèi)參，以目標蛋白與β-actin的IOD（累計光密度）比值計算蛋白相對表達量。

1.9? 免疫組化測定PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL蛋白表達

操作步驟：（1）新鮮小腸樣本固定于甲醛溶液中;（2）石蠟包埋小腸樣本并切片;（3）石蠟切片置于67 ℃烘箱中，烘片2 h，脫蠟后加3%H2O2，室溫下孵育10 min;（4）一抗室溫孵育2 h;（5）二抗孵育30 min;（6）DAB液（二氨基聯(lián)苯胺），顯微鏡下觀察5 min;（7）蘇木素復染，0.1%HCl分化，自來水沖洗，藍化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后拍照觀察分析。

1.10? 統(tǒng)計學方法

本實驗中測得指標均為計量指標，用“x±s”表示，采用SPSS 16.0軟件包進行統(tǒng)計分析，組間比較用方差分析，兩兩比較用q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 乳鼠小腸黏膜組織iEL CD3+T細胞核中PKR蛋白表達

表1結果提示B組PKR蛋白表達隨時間變化，32 h后逐漸升高，40 h達到頂峰，48 h下降（P<0.05）;B組PKR蛋白表達均高于Z組（P<0.05）。BY組PKR蛋白表達高于Y組和M組（P<0.05）;Y組低于M組（P<0.05）。ZY組的32 h PKR蛋白高于M組（P<0.05）;而40 h、48 h PKR蛋白與M組比較無統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2? 乳鼠小腸黏膜組織iEL CD3+T細胞核中eIF-2α蛋白表達

從表2結果可以看出HRV感染后的不同時間乳鼠iELCD3+T細胞核中eIF-2α蛋白相對表達量有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。B組乳鼠小腸黏膜iEL細胞核中 eIF-2α蛋白表達明顯高于N組、M組、Y組、BY組和ZY組（P<0.05）;B組eIF-2α蛋白表達量用藥32 h后逐漸升高，40 h達頂峰，48 h下降，3個時間點比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。B組與Z組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;Z組各時間點eIF-2α蛋白表達與B組比較（P<0.05）。BY組eIF-2α蛋白表達高于Y組和M組（P<0.05）;Y組、ZY組各時間點eIF-2α蛋白表達均低于M組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3? 乳鼠小腸黏膜組織iEL CD3+T細胞核中OAS蛋白表達

表3結果可以看出不同時間點HRV感染乳鼠iELCD3+T細胞核中OAS蛋白相對表達量差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。B組乳鼠小腸黏膜iEL胞核中各時間點OAS蛋白表達均明顯高于N組、M組、Y組、BY組和ZY組（P<0.05）;B組乳鼠OAS蛋白表達隨時間變化逐漸升高，40 h達到頂峰，48 h下降（P<0.05）;B組OAS蛋白表達與Z組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。BY組OAS蛋白表達高于Y組和M組（P<0.05）;40 h、48 h Y組、ZY組OAS蛋白表達分別與M組比較差別無統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.4? 乳鼠小腸黏膜組織iEL CD3+T細胞核中RNaseL蛋白表達

表4各組不同時間點HRV感染乳鼠iEL CD3+T細胞核中RNaseL蛋白相對表達量有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。B組乳鼠小腸黏膜iEL胞核中各時間點RNaseL蛋白表達均明顯高于N組、M組、Y組、BY組和ZY組（P<0.05）;B組RNaseL蛋白表達隨時間變化，32 h后逐漸升高，40 h達到頂峰，48 h下降（P<0.05）;32 h時，B組與Z組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;40、48 h時，B組RNaseL蛋白表達均高于Z組（P<0.05）。BY組RNaseL蛋白表達高于Y組和M組（P<0.05）;Y組RNaseL蛋白表達高于ZY組（P<0.05）;40、48 h ZY組與M組比較差別無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.5? 免疫組化觀察乳鼠小腸組織PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL蛋白表達

40 h時， M組小鼠其小腸組織PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL蛋白表達與N組相比不明顯。B組小鼠其小腸組織PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL蛋白表達高于N組，M組和Z組小鼠，免疫組化結果與Western blotting結果相似。

4 討論

秋末冬初，氣候轉冷，小兒在“臟腑柔弱”“成而未全，全而未壯”“脾常不足”的基礎上，感受風寒，致脾胃功能失常，水反為濕，谷反為滯，水谷并走大腸而致泄瀉;“脾虛”“濕勝”為其病理基礎。七味白術散原名白術散，由人參、白茯苓、炒白術、藿香葉、木香、甘草、葛根組成，由北宋“兒科之圣”錢乙創(chuàng)制。此方以人參、白術、甘草之甘溫，補胃和中;木香、藿香辛溫以助脾，茯苓甘淡，分陰陽，利水濕，葛根甘平，倍于眾藥，其氣輕浮，鼓舞胃氣，上行津液，又解肌熱，是治脾胃虛弱泄瀉之圣藥。

輪狀病毒是一種雙鏈RNA病毒，其主要通過誘導TLR3高表達，從而激活下游炎癥信號通路，引起炎癥因子釋放[16-17]。團隊前期研究表明，輪狀病毒主要通過激活TLR3通路及下游NFκB通路，進而激活炎癥反應并釋放炎癥因子等，在這一過程中TLR3下游MyD88發(fā)揮關鍵作用[18]。七味白術散主要通過選擇性阻斷MyD88，從而抑制下游通路，進一步緩解輪狀病毒引起的炎癥因子釋放。在此過程中七味白術散對TLR3無顯著作用。在輪狀病毒引起變化的諸多細胞因子中，IFNγ被認為是一種主要的抗輪狀病毒的細胞因子，輪狀病毒腹瀉小兒升高的IFNγ水平與疾病的緩解相關[19]。但是，目前關于IFNγ介導輪狀病毒引起腹瀉的機制，以及七味白術散是否對IFNγ下游信號蛋白產(chǎn)生影響等問題還尚未見報道。

DM Bass[20]發(fā)現(xiàn)lFNγ能阻止輪狀病毒侵入小腸細胞，并抑制其在人類小腸Caco2細胞的復制。IFNγ通過JAK-STAT途徑與相應的受體結合，激活信號級聯(lián)反應，誘導AVP生成，從而干擾病毒的感染和復制。AVP包括PKR、OAS、RNase L、RNA特異性腺苷脫氨酶（ADAR）和Mx蛋白。其中最主要的是PKR和OAS，這兩種酶的激活均需要病毒復制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA。PKR是典型的干擾素誘導的抗病毒蛋白[21]，具有調(diào)節(jié)先天免疫的作用[22]。在絕大多數(shù)細胞中，PKR有一定水平的基礎表達，IFN可通過JAK-STAT途徑誘導PKR的轉錄。PKR的氨基末端含有2個保守的dsRNA結合位點，dsRNA能夠活化PKR，導致PKR的構象改變，激活PKR的激酶活性，活化的PKR能夠識別蛋白質(zhì)合成的起始因子eIF-2，并使eIF-2的α亞基51位絲氨酸磷酸化，磷酸化后的eIF失去啟動蛋白質(zhì)翻譯過程的能力，使病毒肽鏈的合成受阻[23-24]。PKR參與機體的抗病毒機制，還與細胞凋亡密切相關，其機制主要是上調(diào)Fas配體等TNF受體家族成員，死亡信號轉導分子FADD以及促凋亡的Bax分子的表達，該作用也可通過eIF-2α和NF-κB介導[25-27]。OAS在靜止細胞中低水平存在，IFN作用時能被強烈誘導。病毒來源的dsRNA能夠激活OAS，OAS在被雙鏈RNA激活后，OAS蛋白將ATP聚合成pppA（2cp5cA）n（n=1或n>1）寡聚體，進而激活潛在的RNaseL，RNaseL能夠降解病毒mRNA，因此，抑制了以RNA作為中介的病毒復制[28]。

本實驗研究表明，七味白術散能促進HRV感染乳鼠小腸粘膜iEL胞核中IFNγ下游AVP蛋白的表達。抗病毒蛋白PKR和OAS共同作用，阻斷病毒蛋白質(zhì)合成并降解病毒mRNA，這可能是七味白術散治療HRV感染性腹瀉的重要機制。

參考文獻

[1] BROQUET A H， HIRATA Y， McAllister C S， et al. RIG-I/MDA5/MAVS are required to signal a protective IFN response in rotavirus-infected intestinal epithelium[J]. Journal of Immunology， 2011，186（3）：1618-1626.

[2] PARASHAR UD AND GLASS RI. Rotavirus vaccines-early success， remaining questions[J]. New England Journal of Medicine， 2009， 360：1063-1065.

[3] 錢? 乙.小兒藥證直訣（實用中醫(yī)古籍叢書）[M].天津：天津科學技術出版社，2000：43.

[4] HE S T， HE F Z， WU C R， et al. Treatment of rotaviral gastroenteritis with Qiwei Baizhu powder[J]. World Journal of Gastroenterology， 2001， 7（5）：735-740.

[5] 賀雙騰，何飛舟，伍參榮，等.七味白術散對人輪狀病毒在培養(yǎng)細胞內(nèi)復制的抑制作用[J].中國中西醫(yī)結合雜志.1995，15（11）：669-671.

[6] 賀雙騰，何飛舟，伍參榮，等.七味白術散治療輪狀病毒腸炎的臨床與實驗研究[J].中國中西醫(yī)結合雜志，1996，16（3）：132-135.

[7] 伍參榮，楊? 波，胡建中，等.七味白術散對人輪狀病毒感染乳鼠胸腺細胞的程序性死亡和IL-2、IL-2R表達的影響[J].湖南中醫(yī)學院學報，2001，21（3）：8-9.

[8] 伍參榮，謝朝暉，賀雙騰.七味白術散對HRV感染乳鼠NK、IFN-γ、IL-4的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2002，9（4）：23-24.

[9] WU C R， XIAO J G， HE S T， et al. Effects of QWBZP on T-cell subsets and their cytokines in intestinal mucosa of HRV infection suckling mice[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2010， 131（1）：130-134.

[10] SU Q， WANG S， BALTZIS D， et al. Tyrosine phosphorylation acts as a molecular switch to full-scale activation of the eIF2alpha RNAdependent protein kinase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2006， 103（1）： 63-68.

[11] KAZEMI S， PAPADOPOULOU S， LI S， et al. Control of alpha subunit of eukaryotic translation initiation factor2 （eIF2 alpha） phosphorylation by the human papillomavirus type 18 E6 oncoprotein： implicationsfor eIF2 alpha-dependent gene expression and cell death[J]. Molecular Biology of the Cell， 2004， 24（8）： 3415-3429.

[12] GOODMAN A G， SMITH J A， BALACHANDRAN S， et al. The Cellular Protein P58IPK Regulates Influenza Virus mRNA Translation and Replication through a PKR-Mediated Mechanism[J]. Journal of Virology， 2007， 81（5）： 2221-2230.

[13] ZHU R， ZHANG Y B， ZHANG Q Y， et al. Functional domains and the antiviral effect of the double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR from paralichthys olivaceus[J]. Journal of Virology， 2008， 82（14）：6889-6901.

[14] Sànchez R and Mohr I. Inhibition of Cellular 2'-5' Oligoadenylate Synthetase by the Herpes Simplex Virus Type 1 Us11 Protein [J]. Virology， 2007， 81（7）：3455-3464.

[15] 周正任，葉曉卉.小鼠小腸上皮內(nèi)淋巴細胞的提取與抗原表型測定和功能的初步研究[J].中國免疫學雜志，2001，17（3）：135-137.

[16] BURNETT E， YEN C， TATE J E， et al. Rotavirus vaccines： current global impact and future perspectives[J]. Future Virology， 2016， 11（10）： 699-708.

[17] YANG X， TWITCHELL E， LI G， et al. High protective efficacy of rice bran against human rotavirus diarrhea via enhancing probiotic growth， gut barrier function， and innate immunity[J]. Scientific Reports， 2015， 5： 15004.

[18] WU C R， ZUO S N， SUN B Q， et al. Qi-Wei-Bai-Zhu powder improves inflammatory response via the myd88 pathway in neonatal mice infected with human rotavirus[J]. Biomedical Research， 2017， 28（20）：9701-9706.

[19] GUERRERO C A， ACOSTA O. Inflammatory and oxidative stress in rotavirus infection. World Journal of Virology， 2016，5：38-62.

[20] BASS D M. Interferon gamma and interleukin 1， but not interferon alfa， inhibit rotavirus entry into human intestinal cell lines[J]. Gastroenterology， 1997， 113（1）： 81-89.

[21] MCALLISTER C S， TOTH A M， ZHANG P， et al. Mechanisms of protein kinase PKR-mediated amplification of beta interferon induction by C protein-deficient measles virus[J]. Journal of Virology， 2010， 84（1）：380-386.

[22] MINOR R A， LIMMON G V， MILLER-DEGRAFF L， et al. Double-stranded RNA-activated protein kinase regulates early innate immune responses during respiratory syncytial virus infection[J]. Journal of Interferon and Cytokine Research， 2010， 30（4）：263-272.

[23] RYMAN K D， WHITE L J， JOHNSTON R E， et al. Effects of PKR/RNase-dependent and alternative antiviral pathways on alphavirus replication and pathogenesis[J]. Viral Immunology， 2002， 15：53-76.

[24] VATTEM K M， STASCHKE K A， WEK R C. Mechanism of activation of the double-stranded-RNA-dependent protein kinase， PKR： role of dimerization and celluar localization in the stimulation of PKR phosphorylation of eukaryotic initiation factor-2（eIF2）[J]. European Journal of Biochemistry， 2001， 268（13）：3674-3684.

[25] KAUFMAN R J. Double-stranded RNA-activated protein kinase mediates virus-induced apoptosis： a new role for an old actor[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1999， 96（21）：11693-11695.

[26] LI S D， GREGORY A P， DING K Y， et al. Molecular basis for PKR activation by PACT or dsRNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2006， 103（26）：10005-10010.

[27] COUTURIER J， MOREL M， PONTCHARRAUD R. Interaction of double-stranded RNA-dependent protein kinase （PKR） with the death receptor signaling pathway in amyloid beta （Abeta）-treated cells and in APPSLPS1 knock-in mice[J]. Journal Biological Chemistry， 2010， 285（2）：1272-1282.

[28] RICARDO SCHEZ， IAN MOHR. Inhibition of cellular 2'-5' oligoadenylate synthetase by the herpes simplex virus type 1 Us11 protein[J]. Journal of Virology， 2007， 81（7）：3455-3464.