小金膠囊的HPLC指紋圖譜建立及主成分分析

明凱利 向陽 楊艷霞 曾添 王丫頭 蔡威 朱雯

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）02-0188-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.09

摘 要 目的：建立小金膠囊的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進行主成分分析。方法：采用HPLC法。色譜柱為Agilent TC-C18（2），流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為240 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為20 μL。以11-羰基-β-乙酰乳香酸為參照，繪制15批樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004 A版）進行相似度評價，確定共有峰，并采用Minitab 17.0軟件進行主成分分析。結果：有1批樣品相似度小于0.800，且與其他14批樣品比較缺13、14、15號共有峰，可能存在質量差異而未進行相關分析。其余14批樣品的HPLC圖譜有15個共有峰，指認了3個色譜峰，分別為槲皮素、穗花杉雙黃酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸；14批樣品的相似度為0.889～0.990。經主成分分析，2個主成分因子的累積方差貢獻率為94.4%，樣品中8、9、11、12、14號共有峰（特別是8、9號共有峰）對應成分的含量變化是導致樣品質量差異的重要原因。結論：所建指紋圖譜及主成分分析結果可為小金膠囊的質量評價提供參考。

關鍵詞 小金膠囊；高效液相色譜法；指紋圖譜；主成分分析

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Xiaojin capsules， and to conduct principal component analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent TC-C18（2） column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% formic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 240 nm， and column temperature was 25 ℃. The sample size was 20 μL. Acetyl-11-keto-β-boswellic acid was used as reference and HPLC fingerprints of 15 batches of Xiaojin capsules were determined. The similarity evaluation of common peaks was conducted by using the TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2004A edition） to confirm common peaks. Principal component analysis was conducted by using Minitab 17.0 software. RESULTS： The similarity of 1 batch of sample was lower than 0.800； there was no common peaks No. 13， 14， 15 in HPLC chromatogram of the batch， compared with other 14 batches. There were 15 common peaks in the HPLC fingerprints of 14 batches of samples and three chromatographic peaks were identified， such as quercetin，amentoflavone， acetyl-11-keto-β-boswellic acid. The similarity of 14 batches ranged 0.889-0.990. Through principal component analysis， accumulative contribution rate of 2 principal component factors was 94.4%. It was indicated that the content change of corresponding components of common peaks No. 8， 9， 11， 12， 14 in samples was an important reason for the quality difference of samples， especially common peaks No.8， 9. CONCLUSIONS： The established HPLC fingerprint and principal component analysis can provide reference for quality evaluation of Xiaojin capsules.

KEYWORDS Xiaojin capsules； HPLC； Fingerprint； Principal component analysis

小金膠囊處方源于中醫經典名方“小金丹”[1]，主要由人工麝香、木鱉子、制草烏、楓香脂、乳香、沒藥、當歸、五靈脂、地龍、香墨等10味中藥材組成，具有散結消腫、化瘀止痛之功效，用于陰疽初起、皮色不變、腫硬作痛、多發性膿腫、癭瘤、瘰疬、乳巖、乳癖等[2]。其作為疽證研究的代表方，臨床上定位為疽證相關疾病的初期或是癰疽類疾病的慢性期，可用于治療甲狀腺結節、淋巴結核、子宮肌瘤、乳腺增生、乳腺癌、前列腺增生等癥[3-4]。

中藥具有多成分、多靶點協同作用的特點，這些特點決定了難以用其中單個或幾個成分來準確、全面地表達中藥的質量和療效，需對中藥質量進行全面控制和多種藥效成分的綜合評價[5-6]。2015年版《中國藥典》（一部）對小金膠囊的質量控制僅規定了鑒別、雜質質量和麝香酮的含量測定[2]，但其作為復方制劑，現行質量標準存在較大局限性，難以全面地評價其質量。指紋圖譜技術是整體表征中藥所含成分及其質量的一種有效方法，是目前中藥及中藥制劑質量控制的有效手段之一[7-8]。因此，本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立了小金膠囊的指紋圖譜，并結合主成分分析進行綜合評價，旨在為其質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2040C CN型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器、Labsolutions工作站（日本Shimadzu公司）；PGJ-10/20-AS型超純水儀（武漢品冠儀器設備有限公司）；UA800-DH型超聲波清洗儀（上海歐河機械設備有限公司）；ME203E型千分之一電子天平、ME104E型萬分之一電子天平、CP225D型十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

穗花杉雙黃酮對照品（批號：111902-201603，純度：97.7%）、11-羰基-β-乙酰乳香酸對照品（批號：111760- 201502，純度：99.3%）、槲皮素對照品（批號：100081- 201610，純度：99.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；小金膠囊（健民藥業集團股份有限公司，批號：160601、170101、170102、 170107、170117、170121、170123、170124、170329、170334、170336、170544、170554、170868、171126，編號：S1～S15，規格：0.35 g/粒）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取穗花杉雙黃酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸、槲皮素對照品適量，分別加甲醇制成穗花杉雙黃酮50 μg/mL、11-羰基-β-乙酰乳香酸50 μg/mL、槲皮素50 μg/mL的單一對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取小金膠囊內容物適量，研細，精密稱定2 g，置于具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定質量，水溫25 ℃以下超聲（功率：300 W，頻率：40 Hz）處理30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：170101）適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，15個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.15%（n=6），相對峰面積的RSD均小于1.70%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：170101）適量，分別于室溫下放置0、2.5、5、7.5、10、12.5、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，15個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.50%（n=7），相對峰面積的RSD均小于1.60%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內基本穩定。

2.3.3 重復性試驗 取小金膠囊（批號：170101）內容物適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，15個共有峰相對保留時間的RSD均小于0.19%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.50%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度評價、共有峰的指認及相關分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取15批小金膠囊內容物適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004 A版）對15批樣品的HPLC圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004 A版），以樣品的HPLC對照指紋圖譜為參照，進行整體相似度評價。結果顯示，15批樣品中有14批樣品相似度大于0.880，其中13批樣品的相似度大于0.900；僅有1批樣品（批號：160601）相似度小于0.800，表明該批樣品與其他樣品間存在質量差異，詳見表2。

2.4.3 共有峰的指認 分別取“2.2.1”項下穗花杉雙黃酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸、槲皮素單一對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并與樣品的HPLC對照指紋圖譜進行對比指認。結果，共有峰中4、6、12號色譜峰分別指認為槲皮素、穗花杉雙黃酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸，詳見圖3。

2.4.4 共有峰的相關分析 14批樣品共有15個共有峰，其峰面積總和占色譜峰總面積的85.7%，詳見表3[因S1批樣品與其他樣品比較，缺13、14、15號共有峰，可能存在質量異常，故該批樣品未進行后續相關分析，僅對其余14批（S2～S15）樣品進行相關分析]。通過與對照品的HPLC圖對比指認，12號峰11-羰基-β-乙酰乳香酸峰的峰面積較大、分離度較好，在HPLC圖譜中較穩定，故以其保留時間和峰面積為參照，計算其他峰相對于12號峰的相對保留時間、相對峰面積及相對標準偏差（RSD），詳見表4、表5。

2.5 主成分分析

以15個共有峰的峰面積為變量（x），將14批樣品15個共有峰數據（14×15）導入Minitab 17.0軟件進行多變量主成分分析[9]，詳見表6。由表6可知，2個主成分因子的累積方差貢獻率為94.4%，提示2個主成分因子可作為評價樣品質量的主要因子。由主成分因子與變量間的系數關系（見表7）分別得2個主成分因子的線性方程：主成分1=-0.009x1+0.003x2+0.018x3+0.036x4+0.001x5+0.003x6+0.017x7+0.591x8+0.696x9+0.056x10+0.128x11+0.263x12+0.073x13+0.257x14+0.068x15；主成分2=-0.009x1-0.042x2-0.142x3-0.146x4+0.025x5-0.012x6-0.042x7-0.736x8+0.550x9+0.053x10-0.203x11+0.234x12-0.041x13+0.089x14+0.034x15（式中x1、x2……x15表示各共有峰的峰面積）。

主成分因子1中，x9、x8的變量系數絕對值較大，其次為x12、x14；主成分因子2中，x8、x9的變量系數絕對值較大，其次為x12、x11。2個主成分因子與15個共有峰峰面積的載荷圖見圖4。由圖4可知，x9、x8、x12、x14、x11這5個共有峰峰面積的變化可反映樣品共有峰的整體變化（特別是8號和9號共有峰），表明樣品中8、9、11、12、14號共有峰對應成分的含量變化是導致樣品質量差異的重要因素（特別是8號和9號成分）。

3 討論

本研究建立了15批小金膠囊的HPLC指紋圖譜，14批樣品共有15個共有峰（因S1批樣品存在較大質量差異，故不納入相關分析），并指認了其中3個成分，分別為槲皮素、穗花杉雙黃酮、11-羰基-β-乙酰乳香酸。

筆者在前期試驗中分別考察了乙醇、甲醇、60%甲醇、甲醇-乙酸乙酯（1 ∶ 1，V/V）、甲醇-乙酸乙酯-三氯甲烷（3 ∶ 3 ∶ 4，V/V/V）為提取溶劑時的提取效果。結果，以甲醇為提取溶劑時，提取率高，提取成分多，且易于濾過，故選擇甲醇為提取溶劑。通過比較超聲提取、加熱回流提取的提取效果，發現超聲提取與回流提取效果相當，但因超聲提取操作簡單、方便，故選擇超聲提取。

此外，筆者對甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸溶液不同流動相，220、240、250、270、300 nm不同檢測波長時的色譜峰進行比較。結果，以檢測波長為240 nm、乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫時，色譜峰峰形較好，無明顯拖尾現象，基線相對平穩、噪音低。故選擇檢測波長為240 nm、流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液梯度洗脫。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜及主成分分析可為小金膠囊的質量評價提供參考。

參考文獻

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（收稿日期：2018-09-06 修回日期：2018-11-21）

（編輯：陳 宏）