康復新液對兔膝關節炎軟骨缺損模型的修復作用及機制研究

王濤 郭英 殷紅 唐曉霞 廖江龍 黃文澤 許燕飛 艾元亮 李金磊 溫輝 楊景帆

中圖分類號 R684.3；R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）02-0197-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.11

摘 要 目的：探討康復新液對兔膝骨性關節炎（KOA）軟骨缺損模型的修復作用及其機制。方法：取雄性新西蘭兔72只，隨機分為模型對照組和康復新低、中、高劑量組，每組18只。采用麻醉后手術鉆孔的方式造成兔右膝關節股骨內側髁軟骨缺損模型，然后立即在軟骨缺損處進行關節腔注射給藥，康復新低、中、高劑量組分別給予體積分數為20%、40%、80%的康復新液，模型對照組給予等體積生理鹽水，0.2 mL/kg，每3天1次持續給藥。于給藥后第4、8、12周時，觀察兔軟骨缺損傷口修復情況；于給藥完畢即刻和給藥后第4、8、12周時，結合Wakitani評分標準對兔軟骨缺損處修復組織進行組織學評分；于給藥后第12周，采用Masson染色法觀察兔關節軟骨缺損處修復組織的病理學變化；采用酶聯免疫吸附法檢測兔關節液中一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化脂質（LPO）和尿液中吡啶酚（PYD）水平。結果：給藥后第4、8、12周時，與模型對照組比較，康復新低、中、高劑量組兔軟骨缺損區修復情況較好；給藥后第4、8、12周時，與給藥完畢即刻及同時間點的模型對照組比較，康復新低、中、高劑量組兔膝關節軟骨缺損處修復組織形態學評分均顯著降低（P<0.05）；給藥后第12周時，與模型對照組比較，康復新低、中、高劑量組兔膝關節軟骨缺損處組織病理學程度明顯減輕；給藥后第4、8、12周時，與模型對照組比較，康復新低、中、高劑量組兔關節液中NO、LPO和尿液中PYD水平均有不同程度地降低，SOD水平均有不同程度地升高，到給藥第12周時，各指標差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。結論：康復新液對KOA軟骨缺損模型兔的軟骨損傷具有明顯的修復作用，其作用機制主要與提高SOD表達并介導NO抑制軟骨細胞凋亡有關。

關鍵詞 康復新液；兔；軟骨缺損；修復作用；機制；一氧化氮；超氧化物歧化酶；過氧化脂質；吡啶酚

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of Kangfuxin liquid on repairing cartilage defect model of knee osteoarthritis （KOA） in rabbits and its mechanism. METHODS： Totally 72 male New Zealand rabbits were selected and randomly divided into model control group and Kangfuxin low-dose， medium-dose， high-dose groups， with 18 rabbits in each group. A cartilage defect model of the medial femoral condyle of the right knee joint in rabbits was established by drilling after anesthesia surgery. Then the rabbits in each group were given medicine via articular cavity immediately. Kangfuxin low-dose， middle-dose and high-dose groups were given 20%， 40%， 80% Kangfuxin liquid； model control group was given constant volume of normal saline consecutively， 0.2 mL/kg， once every 3 days. At 4th， 8th， 12th week after medication， the wound repair of cartilage defect in rabbits was observed. Immediately after medication and at 4th， 8th， 12th week after medication， repaired tissue of cartilage defect in rabbits was scored histologically with Wakitani scoring standard under light microscope. At 12th week after medication， pathological changes of repaired tissue of cartilage defect in rabbits were observed by Masson staining. The levels of NO， SOD and LPO in joint fluid and PYD in urine of rabbits were detected by ELISA. RESULTS： At 4th， 8th， 12th week after medication， compared with model control group， cartilage defects in rabbits were repaired well in Kangfuxin low-dose， medium-dose and high-dose groups. At 4th， 8th， 12th week after medication， compared with immediately after medication and model control group at same time point， histomorphological score of repairing cartilage defect of knee joint in rabbits decreased significantly in Kangfuxin low-dose， medium-dose and high-dose groups （P<0.05）. At 12th week after medication， compared with model control group， the histopathology degree of cartilage defect of knee joint in rabbits was significantly alleviated in Kangfuxin low-dose， medium-dose and high-dose groups. At 4th， 8th， 12th week after medication， compared with model control group， the levels of NO and LPO in joint fluid and PYD level in urine were decreased to different extent in Kangfuxin low-dose， medium-dose and high-dose groups， while SOD level was increased to different extent； at 12th week after medication， the difference of each index has statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Kangangxin liquid can significantly repair cartilage defect of KOA cartilage defect model rabbits， the mechanism of which may be associated with increasing the expression of SOD and mediating NO-inhibited chondrocyte apoptosis.

KEYWORDS Kangfuxin liquid； Rabbits； Cartilage defect； Reparing effect； Mechanism； NO； SOD； LOP； PYD

膝骨性關節炎（Knee osteoarthritis，KOA）是以關節軟骨退變、骨質硬化及增生為病理特征的一種骨關節疾病，具有高發病率、高復發率、高耐藥性的特點；而覆蓋在膝關節表面的膝關節軟骨由于不含血管、神經或淋巴組織，一旦出現損傷，則其自愈能力相當有限[1]。關節腔內注射藥物是治療KOA的主要方法之一，經實踐驗證其療效顯著[2-3]。康復新液是以蜚蠊（俗稱蟑螂）為主藥的一種生物制劑[4]，《神農本草經》記載：蜚蠊“味、咸、寒，生川澤，治血癖癥堅、寒熱，破積聚，喉咽痹，內寒無子”。現代藥理研究表明，康復新液在炎癥介質誘導下能迅速產生或促使多種體液免疫因子參與抑菌，能促進非特異免疫細胞分泌創傷修復因子，促進傷口愈合，還能加快骨修復啟動進程[1]，但其作用機制尚未完全明確。現代醫學認為，骨關節炎是多種因素參與介導的慢性炎癥反應，其致病因素主要與軟骨細胞凋亡有關[1]。基于此，本研究通過建立兔KOA軟骨缺損模型，考察在關節腔注射康復新液對兔關節軟骨病理性改變的影響；同時，通過檢測兔關節液中的一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化脂質（LPO）與尿液中吡啶酚（PYD）水平的變化，旨在探討康復新液防治KOA的作用機制是否與軟骨細胞凋亡有關。

1 材料

1.1 儀器

BM-Ⅶ型生物組織包埋機（湖北省宏業醫用儀器有限公司）；KH-Q350型切片機（河南海闊醫療器械有限公司）；64R型低溫高速離心機（美國Beckman公司）；ELx808型酶聯免疫檢測儀（美國Bioteck公司）；CKX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；立式320L型超低溫冰箱（杭州艾普儀器設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

康復新液（四川好醫生攀西藥業有限責任公司，批準文號：國藥準字Z51021834，規格：10 mL/瓶）；Masson三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1340）；兔NO、SOD、LPO、PYD酶聯免疫檢測試劑盒（上海恪敏生物科技有限公司，批號均為H8021）；pH 7.4磷酸鹽緩沖液[PBS，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為雙蒸水。

1.3 動物

健康成年新西蘭兔72只，雄性，清潔級，5～6月齡，體質量1.5～2.5 kg，購自四川省醫學科學院實驗動物研究所[動物生產許可證號：SCXK（湘）2013-0004，合格證號：0002777]。動物在實驗前適應性飼養1周，自由飲食，環境溫度（22±1）℃，每天12 h光照（8：00-20：00）。

2 方法

2.1 分組、造模、給藥與取樣

取兔72只，隨機分為模型對照組和康復新低、中、高劑量組，每組18只。依據改良型關節刻痕法[1，5]建立膝關節軟骨缺損模型：3%戊巴比妥鈉溶液經兔耳緣靜脈麻醉（1 mL/kg），剃毛，常規消毒右下肢；沿髕骨內緣切口，分離皮下組織，切斷內側關節囊，暴露關節腔；膝關節過伸，向外側脫位髕骨，用2.0 mm克氏針手鉆在膝股骨內側髁中心鉆孔（直徑：3 mm），造成兔股骨內側髁軟骨缺損；然后立即在各組兔軟骨缺損處進行關節腔注射給藥，0.2 mL/kg，每3天1次持續給藥。按人用劑量換算后，對康復新低、中、高劑量組兔分別給予體積分數分別為20%、40%、80%的康復新液（用含10%胎牛血清的DMEM培養液進行稀釋，在超凈臺上用0.22 μm一次性濾器過濾除菌，-20 ℃保存，備用），模型對照組兔給予等體積生理鹽水。

各組兔在給藥完畢即刻和給藥后第4、8、12周時取尿液待測；同時，沿兔髕骨內緣作縱行切口，逐層分離至關節囊，反復屈伸關節以便將關節液擠壓至髕上囊內側，在關節液最集中處輕輕劃開關節囊，注入生理鹽水1.5 mL，反復抽吸后將關節液盡量抽出，在4 ℃下以15 000 r/min離心15 min，取上清液，保存于-80 ℃，待測。各組兔在上述時間點分別處死2只，剝離軟骨缺損周圍組織，在距缺損處上、下、左、右端至少1 mm左右，用鋼鋸截取標本，進行骨修復組織的形態學評分和病理學觀察。取材前動物均禁食不禁水10 h。

2.2 各組兔膝關節軟骨缺損區修復情況觀察

肉眼觀察各組兔在軟骨缺損模型制備完成后的一般情況，并分別于給藥后第4、8、12周時觀察兔軟骨缺損傷口修復情況。

2.3 各組兔膝關節軟骨缺損處修復組織的形態學評分

分別于給藥完畢即刻及給藥后第4、8、12周時，在顯微鏡下對兔軟骨缺損處修復組織的軟骨厚度、基質異染性、表面規則性以及填充軟骨與周圍軟骨的結合情況進行觀察，并結合Wakitani 評分標準[1，6]進行組織學評分（總分0～10分，得分越高，則表明軟骨缺損修復越差）：（1）軟骨厚度>2/3計0分，1/3～2/3計1分，<1/3計2分。（2）對軟骨組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色后評判基質異染性：正常計0分，輕度減少計1分，明顯減少計2分，無異染性著色計3分。（3）表面規則性：光滑>3/4計0分，中等1/2～3/4計1分，不規則1/4～1/2計2分，特別不規則<1/4計3分。（4）填充軟骨與周圍軟骨兩邊緣結合計0分，僅一邊結合計1分，兩邊均未結合計2分。

2.4 各組兔膝關節軟骨缺損處修復組織的病理學觀察

于給藥后第12周，采用經典Masson染色法[7]對軟骨缺損處組織進行染色。取兔膝關節軟骨缺損處組織，石蠟包埋，切片（厚度4 μm）；切片置于載玻片上，常規脫蠟，梯度乙醇脫水；復合性染液（1%桔黃G染色液+苦味酸酶染色液）染色30 min，水洗；蘇木精核染15 min，水洗；復合性染液（麗春紅+酸性復紅染色液）染色10 min，水洗；1%磷鎢酸分化10 min，水快洗；1%亞甲藍染液染色15 min；95%乙醇分色，乙醇快速脫水；二甲苯透明，中性樹膠封片后，在顯微鏡下觀察修復組織的病理學變化。

2.5 各組兔關節液中NO、SOD、LPO和尿液中PYD水平檢測

采用酶聯免疫吸附法檢測兔關節液中NO、SOD、LPO和尿液中PYD水平，按相應檢測試劑盒的說明書步驟操作。

2.6 統計學方法

采用GraphPad prism 5.0軟件對數據進行統計分析。實驗數據以x±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組兔一般情況及膝關節缺損區修復情況

各組兔在軟骨缺損模型建立完成后，一般情況均相對良好：傷口無紅腫，傷口周圍皮溫正常。

給藥后各組兔軟骨缺損傷口愈合情況如下：第4周時，模型對照組兔軟骨缺損傷口凹陷明顯，可見肉芽組織；康復新低、中、高劑量組兔軟骨缺損傷口均凹陷明顯，可見白色骨樣組織。給藥后第8周時，模型對照組兔軟骨缺損傷口處可見少量填充軟骨；康復新低、中劑量組兔軟骨缺損傷口處可見適量填充軟骨；康復新高劑量組兔軟骨缺損傷口處可見少量骨贅形成。給藥后第12周時，模型對照組兔軟骨缺損傷口處凹凸不平；康復新液低劑量組兔軟骨缺損區填平，表面粗糙；康復新中劑量組兔軟骨缺損區填平，但表面欠光滑；康復新高劑量組兔關節軟骨結構良好，缺損區填平，且表面較光滑。

3.2 各組兔膝關節軟骨缺損處修復組織的形態學評分結果

與給藥完畢即刻比較，給藥后第4、8、12周時模型對照組以及康復新低、中、高劑量組兔膝關節軟骨缺損處修復組織的形態學評分均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；與同時間點的模型對照組比較，康復新低、中、高劑量組兔膝關節軟骨缺損處修復組織的形態學評分均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。各組兔膝關節軟骨缺損處修復組織的形態學評分結果見表1。

3.3 各組兔膝關節軟骨缺損處組織病理學變化情況

給藥后第12周時，模型對照組兔膝關節軟骨缺損處組織的軟骨細胞少且分泌的膠原纖維很少，有大量的纖維素生成且排列紊亂；康復新低劑量組兔膝關節軟骨缺損處修復組織的軟骨細胞排列紊亂，軟骨細胞分泌的膠原纖維較少；康復新中劑量組兔膝關節軟骨缺損處修復組織的細胞排列相對規律，軟骨細胞較多但分泌的膠原纖維較少，纖維素較多但排列相對規律；康復新高劑量組兔膝關節軟骨缺損處修復組織的細胞排列規律，軟骨細胞多且排列規律，膠原纖維較多但纖維素明顯減少。各組兔膝關節軟骨缺損處組織病理學變化顯微圖見圖1。

3.4 各組兔關節液中NO、SOD、LPO和尿液中PYD水平檢測結果

給藥完畢即刻，各組兔關節液中NO、SOD、LPO和尿液中PYD水平組間比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。給藥后第4周時，與模型對照組比較，康復新各劑量組兔關節液中NO、LPO和尿液中PYD水平均有不同程度地降低，SOD水平均有不同程度地升高；其中，康復新中、高劑量組兔關節液中NO、SOD、LPO水平，以及康復新高劑量組兔尿液中PYD水平與模型對照組比較差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。給藥后第8周時，與模型對照組比較，康復新各劑量組兔關節液中NO、LPO和尿液中PYD水平均有不同程度地降低，SOD水平均有不同程度地升高；其中，康復新低、中、高劑量組兔關節液中SOD水平，以及康復新中、高劑量組兔關節液中NO、LPO和尿液中PYD水平與模型對照組比較差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。給藥后第12周時，與模型對照組比較，康復新各劑量組兔關節液中NO、LPO和尿液中PYD水平均顯著降低，SOD水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。給藥完畢即刻和給藥后第4、8、12周時各組兔關節液中NO、SOD、LPO和尿液中PYD水平檢測結果見表2～表5。

4 討論

康復新液能改善血液循環，促進肉芽樣組織生長活躍，使成纖維母細胞相對密集，刺激骨生長因子分泌與合成，加快骨修復啟動進程，在骨修復啟動階段能發揮一定作用[1]。KOA治療指南指出：化學藥可緩解KOA患者疼痛、改善關節活動度，但不能抑制KOA的進展，更不能修復關節軟骨損傷[8-9]。而既往臨床實踐已證實，中醫藥可延緩關節軟骨退變，保護關節軟骨，延緩KOA的發展。本研究結果顯示，康復新液給藥后第12周時，模型對照組兔軟骨缺損傷口處凹凸不平，而康復新各劑量組兔軟骨缺損區填平或結構恢復良好，表面粗糙或較光滑。給藥后第4、8、12周時模型對照組和康復新各劑量組兔膝關節軟骨缺損處修復組織形態學評分均顯著降低，而康復新各劑量組的組織形態學評分較之模型對照組也顯著降低。組織病理學觀察結果顯示，給藥后第12周時，不同劑量的康復新液對軟骨缺損處軟骨細胞排列、軟骨細胞分泌膠原纖維均有影響。上述實驗結果表明，康復新液能有效促進軟骨生長，加快KOA模型兔軟骨損傷的修復。

軟骨細胞凋亡是骨關節炎最關鍵的發病機制之一[10]。在骨關節炎的發展過程中，自由基的增加與細胞凋亡呈正相關[11]。NO兼具信息傳導和細胞毒性因子功能，具有廣泛的生理作用：過量的NO會增強膠原酶和金屬蛋白酶活性，抑制基質蛋白多糖合成，增加蛋白聚糖和膠原的裂解；NO水平的升高又可協同各種細胞因子發揮作用，從而抑制軟骨細胞增殖，促進軟骨細胞糖酵解及凋亡，引起骨質破壞，加劇骨關節炎的發展[12]。LPO則是自由基脂質過氧化反應的代謝產物，能損傷細胞及細胞膜的結構，可間接反映出自由基對組織細胞的損傷程度；加之自由基的增加與細胞凋亡呈正相關，因此LPO水平的升高又能從側面反映出骨關節炎炎癥程度及軟骨細胞凋亡情況[13]。SOD是體內清除氧自由基的重要酶，能通過歧化作用清除氧自由基，保護滑膜和軟骨細胞免受損傷；SOD還能通過阻斷細胞色素C依賴的線粒體凋亡途徑來保護細胞[14]。已有研究證實，減少NO、LPO的產生能抑制軟骨細胞凋亡[13]，提高SOD的活性能改善軟骨細胞代謝[15]。本研究結果顯示，與給藥完畢即刻比較，給藥后各時間點模型對照組兔關節液中NO、LPO水平均呈升高趨勢；給予康復新液干預后，兔關節液中NO、LPO水平顯著降低，而SOD水平顯著升高。因此，筆者推測康復新液對KOA模型兔軟骨損傷的修復作用可能是通過抑制脂質過氧化反應而減少自由基的產生，增加SOD表達從而促進自由基的清除，最終減少自由基、抑制軟骨細胞凋亡，從而起到保護和修復軟骨組織的作用。

PYD是一種存在于軟骨中的膠原纖維連接物，也是臨床常用的骨吸收標志物；在發生關節損傷后，膠原中的PYD會被釋放至循環系統中，繼而隨尿液排出，其尿液水平的升高可用于評估骨降解程度進而判斷KOA病情進展情況[16]。本實驗結果顯示，與給藥完畢即刻比較，給藥后各時間點模型對照組兔尿液中PYD水平均呈升高趨勢；給予康復新液干預后，兔尿液中PYD水平顯著降低，表明康復新液能有效修復兔軟骨損傷。

綜上，康復新液對膝關節軟骨缺損模型兔的軟骨損傷具有明顯的修復作用，其作用機制主要與通過提高SOD表達并介導NO抑制軟骨細胞凋亡有關。

參考文獻

[ 1 ] 殷紅.康復新修復兔膝關節軟骨缺損的實驗研究[D].昆明：云南中醫學院，2018.

[ 2 ] KOENIG KM，ONG KL，LAU EC，et al. The use of hyaluronic acid and corticosteroid injections among medicare patients with knee osteoarthritis[J]. J Arthroplasty，2016，31（2）：351-355.

[ 3 ] 崔夢麗，劉雅敏，陳慶，等.中藥治療關節疼痛外用制劑的研究進展[J].風濕病與關節炎，2015，4（9）：76-80.

[ 4 ] 唐曉東.康復新液修復骨缺損的動物實驗研究[D].成都：四川大學，2007.

[ 5 ] PRASADAM I，MAO X，SHI W，et al. Combination of MEKERK inhibitor and hyaluronic acid has a synergistic effect on anti-hypertrophic and pro-chondrogenic activities in osteoarthritis treatment[J]. J Mol Med：Berl，2013，91（3）：369-380.

[ 6 ] WAKITANI S，GOTO T，YOUNG RG，et al. Repair of large fullthickness articular cartilage defects with allograft articular chondrocytes embedded in a collage gel[J]. Tissue Eng，1998，4（4）：429-444.

[ 7 ] KIM J，KIM IS，CHO TH，et al. In vivo evaluation of MMP sensitive high-molecular weight HA-based hydrogels for bone tissue engineering[J]. J Biomed Mater Res A，2010，95（3）：673-681.

[ 8 ] MCALINDON TE，BANNURU RR，SULLIVAN MC，et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee osteoarthritis[J]. Osteoarthritis Cartilage，2014，22（3）：363-388.

[ 9 ] 洪振強，高弘建，蘇友新，等.馬錢子總堿對兔膝骨關節炎模型軟骨損傷修復作用及機制[J].中國中西醫結合雜志，2018，38（8）：991-996.

[10] ZAMLI Z，ADAMS MA，TARLTON JF，et al. Increased chondrocyte apoptosis is associated with progression of osteoarthritis in spontaneous guinea pig models of the disease[J]. Int J Mol Sci，2013，14（9）：17729-17743.

[11] INTEKHAB-ALAM NY，WHILE OB，GETTING SJ，et al. Urocortin protects chondrocytes from NO-induced apoptosis：a future therapy for osteoarthritis？ [J]. Cell Death Dis，2013.DOI：10.1038/cddis.2013.231.

[12] TOMITA M，SATO EF，NISHIKAWA M，et al. Nitric oxide regulates mitochondrial respiration and functions of articular chondrocytes[J]. Arthritis Rheum，2001，41（1）：96-104.

[13] BENTZ M，ZAOUTER C，SHI Q，et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase prevents lipid peroxidation in osteoarthritic chondrocytes[J]. J Cell Biochem，2012，113（7）：2256-2267.

[14] SUGAWARA T，NOSHITA N，LEWEN A，et al. Overexpression of copper/zinc superoxide dismutase in transgenic rats protects vulnerable neurons against ischemic damage by blocking the mitochondrial pathway of caspase activation[J]. J Neurosci，2002，22（1）：209-217.

[15] KALACI A，YILMAZ HR，ASLAN B，et al. Effects of hyaluronan on nitric oxide levels and superoxide dismutase activities in synovial fluid in knee osteoarthritis[J]. Clin Rheumatol，2007，26（8）：1306-1311.

[16] GARNERO P，PIPERNO M，GINEYTS E，et al. Cross sectional evaluation of biochemical markers of bone，cartilage，and synovial tissue metabolism in patients with knee osteoarthritis：relations with disease activity and joint damage[J]. Ann Rheum Dis，2001，60（6）：619-626.

（收稿日期：2018-06-16 修回日期：2018-12-04）

（編輯：段思怡）