HPLC—DAD法同時測定蒙藥森登—4湯散中7種抗風濕活性成分的含量

蘇日塔拉圖 于佳琦 王曦燁 劉景林 徐寧 許良

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）02-0221-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.16

摘 要 目的：建立同時測定蒙藥森登-4湯散中7種抗風濕活性成分兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素和槲皮素含量的方法。方法：采用高效液相色譜-二極管陣列檢測法（HPLC-DAD）。色譜柱為Sil Green C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1 mL/min，檢測波長為238 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。結果：兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素和槲皮素檢測質量濃度的線性范圍分別為8.590～2 290、10.56～3 901、13.00～3 958、8.815～564.2、4.030～257.8、8.130～750.5、7.075～454.2 μg/mL（r≥0.999 1 ）；檢測限分別為0.429 5、0.264 0、0.325 0、0.220 4、0.201 5、0.203 2、0.176 9 μg/mL，定量限分別為 1.030、1.321、1.302、1.397、1.637、0.813 0、0.707 5 μg/mL；精密度、穩定性（48 h）、重復性試驗的RSD均小于2.0%（n=6）；平均加樣回收率分別為96.24%～99.28%，RSD分別為1.03%～1.63%（n=6）。結論：該方法簡便、準確、重復性良好，可用于同時測定蒙藥森登-4湯散中兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素和槲皮素的含量。

關鍵詞 森登-4湯散；高效液相色譜-二極管陣列檢測法；兒茶素；二氫楊梅素；花旗松素；梔子苷；蘆丁；楊梅素；槲皮素；含量

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of 7 kinds of anti-rheumatic active ingredients in Mongolian medicine Sendeng-4 decoction powder， such as catechin， jasminoidin， dihydromyricetin， texifolin， rutin， myricetin and quercetin. METHODS： HPLC-DAD method was adopted. The determination was performed on Sil Green C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 238 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear range of catechin， jasminoidin， dihydromyricetin， texifolin， rutin， myricetin and quercetin were 8.590-2 290， 10.56-3 901， 13.00-3 958， 8.815-564.2， 4.030-257.8， 8.130-750.5， 7.075-454.2 μg/mL （r≥0.999 1）， respectively； the limits of detection were 0.429 5， 0.264 0， 0.325 0， 0.220 4， 0.201 5， 0.203 2， 0.176 9 μg/mL， respectively； the limits of quantification were 1.030， 1.321， 1.302， 1.397， 1.637， 0.813 0， 0.707 5 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability （48 h） and repetition tests were all lower than 2.0% （n=6）. The average recoveries were 96.24%-99.28% （RSD=1.03%-1.63%， n=6）. CONCLUSIONS： The established method is simple， accurate and reproducible， and can be used for simultaneous determination of catechin， jasminoidin， dihydromyricetin， texifolin， rutin， myricetin and quercetin in Mongolian medicine Sendeng-4 decoction powder.

KEYWORDS Sendeng-4 decoction powder； HPLC-DAD； Catechin； Dihydromyricetin； Texifolin； Jasminoidin； Rutin； Myricetin； Quercetin； Content

蒙藥森登-4湯散是蒙醫臨床常用的抗風濕成藥，于1881年收錄于蒙醫學家吉格木德丹金扎木蘇著作《觀者之喜》[1]，并收載于《傳統蒙藥與方劑》[2]。該藥由4味藥組成，其中文冠木15 g，川楝子9 g，梔子3 g，訶子3 g；具有清熱、燥黃水的功效，用于治療痛風、關節炎、水腫等病癥。近年來對森登-4湯散的化學成分、藥理及毒理作用、含量測定、煎煮及提取工藝、指標成分的藥動學、譜效關系、抗風濕作用機制的代謝組學、配伍機制等方面的研究已有報道[3-8]。為了進一步闡明森登-4湯散藥效物質基礎及其抗風濕作用機制及組方原理，內蒙古民族大學許良課題組研究建立了同時測定[9]森登-4湯散中兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素和槲皮素7種活性成分的高效液相色譜-二極管陣列檢測法（HPLC-DAD）。

1 材料

1.1 儀器

600型高效液相色譜儀，配有2996型光電二極管檢測器、717型自動進樣器、600型四元泵（美國Waters公司）；AB-135S型電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；HH-S26S型數顯恒溫水浴鍋（常州市金壇大地自動化儀器廠）；KQ-250DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；2B型玻璃儀器氣流烘干器（山東華魯電熱儀器有限公司）；SHZ-CB型循環水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；B-220型恒溫水浴鍋、RE-52CS型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 藥材、藥品與試劑

4種蒙藥材文冠木（批號：20150812）、訶子（批號：20161002）、梔子（批號：20151101）、川楝子（批號：20160108）均購自通遼市北方藥材市場，由內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室蘇日塔拉圖副主任蒙藥師鑒定，其中文冠木藥材為無患子科植物文冠木（Xanthoceras sorbifolia Bunge.）的干燥莖干；川楝子藥材為楝科植物川楝（MeLia toosendan Sieb.et Zucc.）的干燥成熟果實；梔子藥材為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis.）的成熟果實；訶子藥材為使君子科植物訶子（Terminalia chebula Retz.）的成熟果實。按文冠木15 g、川楝子9 g、梔子3 g、訶子3 g的處方比例，制成粗粉，過篩，混勻，即得6批樣品（批號分別為20160115、20160130、20160215、20160228、20160302、20160510）。

花旗松素對照品（批號：A0082，純度：99.2%）由成都曼思特生物科技有限公司提供；槲皮素對照品（批號：110081-200907，純度：98.6%）、梔子苷對照品（批號：110749-200511，純度：98%）、兒茶素對照品（批號：110877-201203，純度：98.5%） 、蘆丁對照品（批號：00809705，純度：99%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；楊梅素對照品（批號：100504，純度：>98%）、二氫楊梅素對照品（批號：101206，純度：98.9%）均購自上海融禾醫藥科技發展有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，乙醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Sil Green C18（250 mm×4.6 mm，5 μm ）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～4 min，8%A→9%A；4～13 min，9%A→10%A；13～33 min，10%A→14%A；33～45 min，14%A→16%A；45～48 min，16%A→20%A ；48～70 min，20%A→21%A；70～80 min，21%A→30%A ；80～90 min，30%A→32%A；90～100 min，32%A→100%A；100～105 min，100%A；105～106 min，100%A→8%A ；106～110 min，8%A ）；流速：1 mL/min；檢測波長：238 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品及混合對照品溶液 精密稱取對照品楊梅素1.876 5 mg、兒茶素1.792 5 mg、槲皮素1.690 0 mg、 花旗松素3.257 5 mg、二氫楊梅素2.725 0 mg、 梔子苷1.077 5 mg、蘆丁1.327 5 mg，分別置于5 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得單一對照品溶液。精密稱取單一對照品楊梅素3.753 mg、兒茶素11.45 mg、 槲皮素2.271 mg、花旗松素2.821 mg、二氫楊梅素19.79 mg、梔子苷19.50 mg、蘆丁1.289 mg，置于同一5 mL量瓶中，以甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液。根據所需將混合對照品溶液用甲醇稀釋不同的倍數，即得到7種濃度的混合對照品溶液。

7種混合對照品溶液中，楊梅素質量濃度分別為0.008 130、0.032 50、0.130 0、0.260 0、0.404 5、0.509 9、0.750 5 mg/mL；兒茶素質量濃度分別為0.008 590、0.034 44、0.137 5、0.275 0、1.038、1.600、2.290 mg/mL；梔子苷質量濃度分別為0.010 56、0.042 25、0.169 0、0.338 0、0.975 1、1.950、3.901 mg/mL；二氫楊梅素質量濃度分別為0.013 00、0.052 00、0.104 0、0.416 0、0.989 5、1.980、3.958 mg/mL；花旗松素質量濃度分別為0.008 815、0.017 63、0.035 26、0.070 53、0.141 1、0.282 1、0.564 2 mg/mL；蘆丁質量濃度分別為0.004 03、0.008 060、 0.016 11、0.032 23、0.064 45、0.128 9、0.257 8 mg/mL；楊梅素質量濃度分別為0.008 130、0.032 50、0.130 0、0.260 0、0.404 5、0.509 9、0.750 5 mg/mL；槲皮素質量濃度分別為0.007 075、0.014 19、0.028 39、0.056 78、0.113 6、0.227 1、0.454 2 mg/mL。以上溶液均于4 ℃冷藏、備用。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取森登-4樣品1.000 0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇10 mL，稱定質量，超聲（功率：300 W，頻率：50 kHz）2次，每次20 min，放冷，再稱定質量，用95%乙醇補足減失的質量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照品溶液 精密稱取缺文冠木和梔子的森登-4樣品1.000 0 g，按“2.2.2”項下方法處理和操作，得陰性對照品溶液。

2.3 系統適用性試驗

分別精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結果，在該色譜條件下，各被測成分之間、被測成分與雜質峰均基線分離，7種成分的分離度均大于1.5，理論板數按梔子苷峰計大于5 000，詳見圖1。

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液 10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并行進樣6次，取平均值。以待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，線性關系考察 結果詳見表1。

結果表明，7種成分在一定濃度范圍內，其質量濃度與峰面積之間具有良好的線性關系。

2.5 檢測限與定量限考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為3 ∶ 1時得檢測限；當信噪比10 ∶ 1時得定量限。結果，兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素、槲皮素的檢測限分別為0.429 5、0.264 0、0.325 0、0.220 4、0.201 5、0.203 2、0.176 9 μg/mL，定量限分別為 1.030、1.321、1.302、1.397、1.637、0.813 0、0.707 5 μg/mL。

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素、槲皮素峰面積的RSD值分別為0.82%、0.64%、1.22%、0.90%、0.38%、1.71%、0.84%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20160130）10 μL，分別于室溫下放置0、 2、4、12、 24、 48 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素、槲皮素的峰面積RSD值分別為0.67%、0.89%、1.00%、1.31%、0.51%、0.29%、1.90%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批森登-4湯散樣品（批號：20160130）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品平均含量。結果，兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素、槲皮素峰面積RSD值分別為0.16%、0.18%、0.12%、0.007 5%、0.005 2%、0.004 8%、0.006 3%（n=6），含量的平均值分別為1.592、3.978、3.866、0.367 8、0.125 4、0.543 3、0.187 6 mg/g，表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取森登-4湯散樣品（批號：20160130） 適量，共6份，每份約1.000 0 g，共6份，精密稱定，分別置于25.00 mL量瓶中，分別精密加入兒茶素（0.358 5 mg/mL）、梔子苷（0.215 5 mg/mL）、二氫楊梅素（0.545 0 mg/mL）、花旗松素（0.651 5 mg/mL）、蘆丁（0.265 5 mg/mL）、楊梅素（0.375 3 mg/mL）和槲皮素（0.338 0 mg/mL）單一對照品溶液，其中低濃度組加1.00 mL、中濃度組加2.00 mL、高濃度組加3.00 mL。按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，詳見表2。

2.10 樣品含量測定

取6批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，并行測定3次，記錄峰面積并計算樣品平均含量，測定結果見表3。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇

本試驗分別用95%乙醇回流提取法（回流提取2次，每次1.5 h）和超聲提取法提取（功率：300 W，頻率：50 kHz，超聲2次，每次20 min）供試品中7種成分，對所得到的提取物的HPLC譜圖做了比較，從中選擇供試品提取方法。結果發現，采用超聲提取法制備供試品溶液的HPLC譜圖中7種成分的干擾成分少，色譜峰形和分離度均優于乙醇回流提取方法所提取物。因此，本試驗選擇超聲提取法制備供試品溶液。

3.2 檢測指標的選擇

內蒙古民族大學許良課題組對森登-4湯散血液中檢測到的成分研究表明，蘆丁、槲皮素和梔子苷等成分為該方中的抗風濕藥效成分，該結論在這3種成分的抗炎鎮痛藥理作用研究中得到佐證[10-11]；二氫楊梅素、楊梅素和兒茶素具有抗炎等多種生物活性[12-14]；花旗松素有增強免疫力功效[15]。因此，森登-4湯散中上述7種成分含量的同時測定對森登-4湯散的質量控制具有現實意義，也能對后續復方藥物提取工藝優化中用多指標評價工藝提供方法依據。

3.3 色譜條件的選擇

3.3.1 流動相 色譜條件考察中，筆者曾分別采用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，并梯度洗脫。結果發現，用乙腈-0.1%磷酸溶液作流動相時，7種待測成分的色譜峰形、分離度均良好，最終選用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相[16]。

3.3.2 檢測波長 本研究采用DAD檢測器對供試品溶液在200～400 nm 波長范圍內進行掃描。結果發現，兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素和槲皮素在238 nm波長處具有較強的紫外吸收，均能檢測到良好的色譜信號，在此波長處7種待測成分色譜峰均無干擾峰。因此選擇238 nm作為檢測波長。

3.3.3 柱溫 本試驗表明，室溫（25 ℃）下槲皮素的保留時間不夠穩定，而柱溫控制在30 ℃時其保留時間穩定，其余6種成分未受柱溫影響，故最終選用30 ℃為柱溫。

3.4 含量測定結果分析

森登-4湯散中兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素和槲皮素的平均含量分別為1.598、3.981、3.870、0.367 9、0.126 8、0.548 6、0.186 9 mg/g，即梔子苷含量最高，二氫楊梅素含量次之，而蘆丁含量最低。森登-4湯散中某種成分的含量高低由原藥材中該成分的相對含量、組方中該藥材的比例、藥材來源、貯藏以及配伍之后該成分的溶出度等因素有關。6批樣品中7種成分含量之間無明顯差異（RSD<2.0%），說明生產6批蒙藥森登-4湯散所用的4種藥材質量相對穩定。

綜上，本研究所建立森登-4湯散中7種成分含量的測定方法專屬性強、穩定、精密度和準確度良好，可用于森登-4湯散中上述7種成分含量的同時測定。

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（收稿日期：2018-04-30 修回日期：2018-12-04）

（編輯：余慶華）