北京主栽西瓜品種標準樣品SSR標記指紋構建與應用

吳明生 趙海艷 彭瑞迪 律寶春

摘? ?要：基于毛細管電泳技術，利用24對多態性SSR標記引物構建了13個北京地區主栽西瓜品種標準樣品DNA指紋，并通過北京市農作物品種標準樣品信息管理系統實現指紋信息的共享和應用，為這些西瓜品種的鑒定和品種權保護提供了技術支撐，并為規范北京西瓜產業發展保駕護航。

關鍵詞：西瓜;主栽品種;標準樣品;SSR標記;指紋構建;應用

西瓜作為北京市優勢經濟作物，在京郊農業生產中發揮著重要作用。但是近年來，西瓜品種“多、亂、雜”現象日趨嚴重，優良品種套牌侵權行為時有發生，不僅擾亂了種業市場，危及農業生產，也打擊了育種者的積極性，并影響著種子產業健康發展。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料

供試的13個西瓜品種均為北京地區主要栽培品種，包括京秀、航興1號、航興3號、北農天驕2號、暑寶6號、京欣1號、京欣2號、京欣3號、京欣無籽1號、紅小帥、黃小玉、黑美人和黑晶，所有品種的標準樣品種子由北京市農作物品種標準樣品庫提供。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ?DNA提取

每份試驗材料取50粒種子混合研磨，之后從其中取100 mg粉末置于1.5 mL離心管中，采用新型植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取西瓜基因組DNA。

1.2.2? ?SSR引物設計

24對西瓜多態性SSR標記引物參照吳明生等[1]，所有引物采用熒光標記，由美國應用生物系統公司合成，引物信息見表1。

1.2.3? ?PCR擴增

PCR反應體系為：1×Taq Buffer，MgCl2 2.5 mol/L，dNTPs 0.15 mol/L每種，引物0.25 μmol/L每種，Taq 聚合酶0.1 U，DNA模板50 ng，總體積20 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min、94 ℃變性30 s、58 ℃退火35 s、72 ℃延伸45 s，共36個循環，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.4? ?電泳與數據分析

通過毛細管電泳儀（ABI 3500XL）對PCR產物進行電泳，分子量內標為Liz600，利用ABI GeneMapper 5.0軟件對采集的原始數據進行片段分析。

1.2.5? ?遺傳聚類分析

SSR擴增分離結果采用0、1統計方法，在同一分子量上，“有帶”記為1，“無帶”記為0。通過NTSYS-pc

Version 2.0軟件，按照非加權配對算數平均法（UPGMA）完成遺傳聚類。

2? ?結果與分析

2.1? ?引物分組及多重電泳

為了提高指紋數據采集的效率，采用8重毛細管電泳技術，即將24對引物分成3組，8對引物為一組（即引物Panel），采用四色熒光（FAM、VIC、PET、NED）對引物進行標記，確保同一組中的相同熒光標記的引物之間擴增片段大小區間不重疊（表1），這樣就可以將每組引物擴增的產物混合在一起電泳。同時通過Gene Mapper軟件對每對引物的等位基因進行命名，設置每個等位基因讀值區間（即Bin，結果未顯示），利用Gene Mapper軟件對采集的原始指紋數據進行快速分析，自動確定每個位點的基因型。

2.2? ?標準樣品指紋采集

標準樣品指紋采集通過雙人比對的方式，即兩人分別取50粒種子，樣品粉碎、DNA提取、PCR擴增、電泳及指紋信息讀取都單獨進行。當兩人采集的指紋信息比對完全一致的，則直接記錄為該品種的指紋信息;對于不一致的指紋信息，需要查找原因，進行再次測試確認，直到結果一致。13個西瓜品種最終采集指紋數據信息是312個（圖1），采集成功率100%，其中一次測試就確認的信息282個，占比90.4%;再次測試確認的30個，占比9.6%，主要集中在P4號引物和P23號引物，共計18個，占再次確認的60%。

2.3? ?品種近似性分析

根據“0、1”規則，利用采集的指紋信息，通過NTSYS-pc Version 2.0軟件對13個品種進行遺傳聚類和近似性分析（圖2），結果顯示京欣2號和京欣無籽1號最為近似，近似系數達到0.97，差異2個位點，其余品種間差異位點都在6個以上，說明北京主栽西瓜品種間的遺傳背景較為廣泛，具有較好的多樣性。

2.4? ?指紋信息共享應用

為了推進標準樣品指紋信息的共享應用，將所有品種的指紋數據及峰型圖錄入北京市農作物品種標準樣品信息管理系統（軟件證書登記號：3442753），用戶可以利用系統查詢相關品種的指紋信息，并可以將自己所做樣品的指紋信息與系統里的標準樣品指紋信息進行比對，以此分析樣品的真偽，從而為品種鑒定和品種權保護提供技術支撐。

3? ?討論

DNA標記指紋技術在玉米、水稻等主要農作物品種鑒定上得到廣泛應用[2-4]，為其品種權保護提供了重要的技術保障，有效遏制了品種權侵權、假冒違法行為。然而像西瓜、番茄、辣椒等非主要農作物，指紋鑒定技術研究相對較少，目前也沒有權威已知品種指紋數據庫，品種鑒定更多的還是依賴于田間種植鑒定，不僅費時費力，而且時效性差。

在沒有相關成熟技術標準的條件下，為更好地開展北京市優良西瓜品種快速鑒定與品種權保護工作，本研究在前期引物篩選的基礎上，利用征集的標準樣品構建了北京市主要栽培西瓜品種的SSR指紋，并通過網絡平臺實現指紋信息的共享和比對，為西瓜品種真實性快速鑒定提供了重要的輔助作用。下一步將根據品種推廣的情況，采集更多優良西瓜品種的指紋信息，同時將指紋鑒定結果與田間種植鑒定結果進行比較，對標記引物進一步優化，提高品種鑒定的準確性。

參考文獻：

[ 1 ] 吳明生，牛茜，田雅欄.西瓜品種SSR標記鑒定引物的篩選與分析[J].作物雜志，2014（5）：38-42.

[ 2 ] 王鳳格，楊揚，易紅梅，等.中國玉米審定品種標準SSR指紋庫的構建[J].中國農業科學，2017，50（1）：1-14.

[ 3 ] 陸徐忠，倪金龍，李莉，等.利用SSR分子指紋和商品信息構建水稻品種身份證[J].作物學報，2014（5）：823-829.

[ 4 ] 匡猛，楊偉華，許紅霞.中國棉花主栽品種DNA指紋圖譜構建及SSR標記遺傳多樣性分析[J].中國農業科學，2011，44（1）：20-27.

（收稿日期：2019-08-14）