臭牡丹含藥血清對人肝癌MHCC97-H細胞周期和凋亡的影響

胡琦 蔣佳紅 李游 鄧知敏 石媛媛 盧丹陽 朱克儉

〔摘要〕 目的 觀察臭牡丹含藥血清對B淋巴細胞瘤/白血病-2（Bcl-2）和Bcl-2相關x蛋白（Bax）蛋白表達及人肝癌MHCC97-H細胞周期、凋亡的影響，探討其抗肝癌的可能機制。方法 15%臭牡丹高、中、低劑量含藥血清作用于MHCC97-H細胞，顯微鏡下觀察細胞形態的變化;AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡;流式細胞儀檢測細胞周期;Western blot法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達的變化。結果 不同劑量臭牡丹含藥血清作用于細胞后，細胞形態發生稀疏雜亂、折光性增強等改變;流式細胞術結果顯示，隨含藥血清濃度的增加，細胞的凋亡比例和G2/M期細胞比例亦相應增加，S期細胞比例降低，中、高劑量組與模型組比較，差異顯著（P<0.05）;Western blot法結果顯示不同濃度臭牡丹含藥血清干預下各組Bax蛋白的表達水平上調，Bcl-2蛋白的表達降低（P<0.01）。結論 臭牡丹含藥血清可以促進MHCC97-H肝癌細胞凋亡并阻止其細胞周期，機制可能與上調Bax蛋白，下調Bcl-2蛋白，影響Bax/Bcl-2比值有關。

〔關鍵詞〕 臭牡丹;B淋巴細胞瘤/白血病-2;Bcl-2相關x蛋白;細胞周期;細胞凋亡

〔中圖分類號〕R285.5;R735.7;R73-3 ? ?〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.12.005

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Clerodendron Bungei drug-containing serum on B lymphocyte/leukemia-2 （Bcl-2） and Bcl-2 related X protein （Bax） protein expression and cell cycle and apoptosis of human hepatocarcinoma MHCC97-H， and to explore its possible mechanism. Methods The medicinal serum of 15% Clerodendron Bungei high， medium and low dose drug-containing serum was applied to MHCC97-H cells. The changes in cell morphology were observed using a microscope; The apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI double staining method. The flow cytometry was used to detect cell cycle; Western blot was used to detect Bcl-2 and Bax protein expression. Results After different doses of Clerodendron Bungei drug-containing serum were acting on cells， and the cell morphology was sparse and disordered， and the refractive index was enhanced. The results of flow cytometry showed that with the increase of serum concentration， the proportion of cells in apoptosis and the proportion of cells in G2/M phase increased， and the proportion of cells in S phase decreased. The difference between medium and high dose groups was significantly different from that of the model group （P<0.05）. The results of Western blot showed that the expression levels of Bax protein in each group were up-regulated and the expression of Bcl-2 protein was decreased （P<0.01）. Conclusion The drug-containing serum of Clerodendron Bungei can promote the apoptosis of MHCC97-H hepatoma cells and prevent its cell cycle. The mechanism may be related to up-regulating Bax protein， down-regulating Bcl-2 protein and affecting the ratio of Bax/Bcl-2.

〔Keywords〕 Clerodendron Bungei; B cell lymphoma/leukemia-2; Bcl-2-associated X protein; cell cycle; apoptosis

肝癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，《全球癌癥報告2018》中數據顯示，我國肝癌新增患病人數居世界首位，5年實際生存率僅約為33%，死亡人數高達全球死亡人數的42%[1]。目前肝癌治療首選是手術，但因其起病隱匿、進展迅速，往往發現時就已是中晚期，失去手術機會，即使10%～20%小部分行手術切除患者，術后復發的比例仍然高達57%～81%，術后2年復發率甚至達70%以上[2]。所以尋找對肝癌低毒高效的藥物是改善肝癌療效及預后的重要研究方向之一。臭牡丹是我國著名中醫藥學家歐陽锜研究員發掘出的民間治療惡性腫瘤單方，一直被湖湘歐陽氏雜病流派傳承人習用于各種惡性腫瘤的治療。其效活血散瘀、祛風解毒、消腫止痛，與肝癌“化瘀解毒、消瘤散結”的中醫治療原則相符合。課題組結合多年的臨床經驗和科研實踐，通過前期體內外實驗研究，發現臭牡丹可以抗肝癌的發生發展[3-6]，但細胞凋亡相關機制較少涉及，也罕見文獻報道。本研究選取人肝癌MHCC97-H細胞株，從細胞凋亡因子Bcl-2和Bax為切入點，觀察臭牡丹含藥血清對肝癌MHCC97-H細胞凋亡和周期的影響并探討其抗肝癌的可能機制，為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 ?動物

實驗動物選取20只6～8周齡SPF級雄性健康SD大鼠，采購于湖南斯萊克景達實驗動物公司，體質量控制在250～280 g，動物許可證號：SYXK（湘）2013-0005。

1.2 ?細胞

人肝癌細胞株MHCC97-H（庫號：ZQ0020）采購于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.3 ?藥物

從湖南省中醫藥研究院附屬醫院中藥房購臭牡丹飲片，依照《湖南省中藥材標準》，鑒定為馬鞭草科大青屬植物臭牡丹Clerodendrum bungei Steud.的地上部分。

1.4 ?主要試劑與儀器

胎牛血清（美國Gibco公司，批號：10099141），胰酶消化液（碧云天公司，批號：C0201），DMEM培養基（美國Gibco公司，批號：11965-092），Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基，批號：KGA106），Bcl-2、Bax、β-actin 抗體（美國Proteintech公司，貨號分別為：60178-1-Ig、50599-2-Ig、60008-1-Ig）。電泳儀（美國Bio-rad公司，164-5050），DSZ2000X倒置生物顯微鏡（中國北京中顯恒業儀器廠），Cyto FLEX流式細胞儀（美國Beckman公司），DYCZ-40A轉膜儀（中國北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 ?臭牡丹提取物的制備

用臭牡丹飲片適量，加水回流提取2次，第1次加12倍量水，浸泡1 h，回流提取1 h，第2次加7倍量水，回流提取1 h，濾過，合并濾液，濃縮至每毫升相當于2 g生藥，加入95%乙醇，調整含醇量為60%，沉淀24 h后進行抽濾，濾液回收乙醇至無醇味，繼續濃縮至每毫升浸膏相當于5 g生藥（經換算，每1 g浸膏相當于臭牡丹生藥4.14 g），灌裝，滅菌，即得。

2.2 ?含藥血清的制備

20只雄性SD大鼠隨機分成4組，每組5只。即模型組和臭牡丹提取物高、中、低劑量組。臭牡丹提取物根據60 kg成人體質量0.5 g/kg臭牡丹生藥用量計算，高、中、低劑量分別為2.18、1.09、0.55 g/kg，模型組給予生理鹽水。小鼠每日進行2次灌胃，第3天末次給藥1 h之后，乙醚進行常規麻醉，然后腹主動脈取血，分離血清。將同組大鼠血清混合均勻，過濾后儲存以供之后實驗使用。

2.3 ?細胞形態的觀察

常規培養MHCC97-H細胞至對數生長期，次日加入15%濃度的高、中、低劑量組含藥血清進行培養，48 h后顯微鏡下觀察各組含藥血清干預后細胞的形態學變化。

2.4 ?細胞凋亡的檢測

待藥物分別干預48、72 h后，用PBS洗后，過300目篩，重懸細胞于Binding Buffer中，加入5 μL Annexin V-FITC及Propidium Iodide混勻，在避光條件下室溫反應5～15 min，1 h內進行流式細胞儀檢測。

2.5 ?細胞周期的檢測

待藥物干預細胞72 h之后，對細胞懸液進行收集，離心后得細胞沉淀，用PBS液洗滌2～3次，加入預冷的100%乙醇1.2 mL，使其終濃度為75%，4 ℃ 放置過夜固定。固定后將乙醇溶液去掉，加入 PI（碘化丙啶）工作液150 μL，在4 ℃避光條件下染色30 min。轉至流式檢測管，進行檢測。

2.6 ?Western blotting測定Bax和Bcl-2蛋白的表達水平

待藥物干預細胞72 h之后，嚴格遵照BCA蛋白定量試劑盒（Wellbio）的操作步驟進行實驗，將細胞總蛋白進行分離和提取，用苯二甲芐基氯化銨蛋白濃度測定法對蛋白進行定量。用化學發光試劑曝光顯影，掃描底片，蛋白相對表達量以灰度值比值表示。

2.7 ?統計學處理

SPSS 21.0統計軟件處理，計量資料以“x±s”表示，并進行正態性及方差齊性檢測，符合正太性及方差齊性則使用單因素方差分析，如不滿足，則進行秩和檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 ?臭牡丹含藥血清MHCC97-H細胞形態的影響

倒置顯微鏡下，模型組MHCC-97H細胞貼壁良好，胞漿豐富，呈多邊形，相鄰細胞生長融合成片;臭牡丹各組干預后，細胞形態發生變化，細胞變得稀疏雜亂、折光性增強，培養基中漂浮的細胞增多，中、高劑量組尤為明顯。見圖1。

3.2 ?臭牡丹含藥血清對MHCC97-H細胞凋亡的影響

高劑量組與模型組相比，MHCC97-H細胞的凋亡比例明顯增加。相同劑量藥物干預48 h和72 h誘導凋亡的效果差異不明顯，模型組48 h和72 h的凋亡率分別為8.35%、8.31%，與臭牡丹組各時間段最大凋亡率19.48%、19.72%比較，差異顯著（P<0.05）。見圖2和圖3。

3.3 ?臭牡丹含藥血清對MHCC97-H細胞周期的影響 臭牡丹含藥血清干預后各劑量組S期細胞比例降低，與模型組比較，有顯著差異（P<0.05），中、高劑量組G2/M期細胞明顯增多（P<0.05）。各劑量組G0/G1期細胞與模型組比較，無明顯變化，提示臭牡丹含藥血清阻滯細胞由G2/M期進入G0/G1期，進一步減少S期，干擾DNA復制，從而抑制細胞增殖。見表1。

3.4 ?臭牡丹含藥血清對凋亡相關因子Bax和Bcl-2蛋白的表達的影響

Western blotting 結果顯示，Bax蛋白表達量顯著增加，以中、高劑量組尤為明顯（P<0.01）。而Bcl-2蛋白的表達量均減少，高劑量組最為明顯，與模型組相比差異顯著（P<0.01）。各給藥組Bax/Bcl-2 蛋白比值呈現上升趨勢，與模型組比較，差異具有統計學意義（P<0.01）。見表2和圖4。

4 討論

肝癌在全球惡性腫瘤中發病率居第5位，病死率居第3位[7]，因其發病快、發現難及預后差等特點，嚴重威脅人類健康。隨著醫學科學的不斷進步發展，雖然一部分早期肝癌病人能得到妥善和規范的手術治療。但是，由于大部分患者確診時已到中晚期，且大多伴有肝硬化等嚴重并發癥，能夠進行早期手術切除治療者畢竟是小部分[8]。近年來傳統中醫藥治療腫瘤方面顯示出的獨特優勢而日益被重視，不僅可以改善腫瘤患者的癥狀、提高患者生活質量，而且在延長生存期方面有一定效果。研究初步提示許多單味中藥都能一定程度抑制原發性肝癌的發生發展[9]。臭牡丹是著名中醫藥學家歐陽錡研究員發掘，湖湘歐陽氏雜病流派傳承人治療惡性腫瘤的習用中藥，具有“活血散瘀、祛風解毒、消腫止痛”之功，是符合肝癌中醫用藥原則的中草藥。

近年來多項研究表明，腫瘤的發生、發展與細胞凋亡過程關系頗為密切，凋亡過程的異常可能導致或促進腫瘤的發生[10-11]。Bcl-2和Bax蛋白是細胞凋亡過程中的關鍵因子，在肝癌等多種腫瘤中表達異常，已成為當今多種抗癌藥物的作用靶點之一[12]。在有“死亡開關”之稱的Bax/Bcl-2比值中，Bcl-2基因可抑制細胞凋亡，而 Bax基因作為Bcl-2的同源基因，能促進細胞凋亡，該比值在細胞接受刺激信號后是否存活起關鍵作用。換而言之，Bcl-2/Bax比值越低，細胞亡率高，反之，細胞生存率高。因此，無論是上調Bax，或下調Bcl-2都可以促進包括肝癌在內的多種腫瘤細的胞凋亡[13]。如郭芳等[14]實驗證明莪術醇能體內外誘導乳腺癌MCF-7細胞的凋亡，其機制與調控Bcl-2蛋白表達和Bax蛋白表達，下調Bcl-2/Bax比例有關;另有研究發現，乳腺癌、淋巴瘤及肝癌等多種惡性腫瘤的發生發展都與Bcl-2的異常表達關系密切[15-16];國外也有研究發現，敲除Bax等促凋亡基因后正常細胞發生癌變的幾率大大增加[17-18]。

根據前期研究基礎和現狀分析，在本實驗中，我們從細胞凋亡角度探討臭牡丹含藥血清對MHCC97-H肝癌細胞周期、凋亡的影響。首先通過鏡下觀察MHCC97-H細胞形態的變化，然后檢測細胞的周期和凋亡情況。結果顯示，與模型組相比，臭牡丹含藥血清組干預后，細胞出現稀疏雜亂、折光性增強等改變，且細胞凋亡率和G2/M期細胞比例亦相應增加，S期細胞比例降低，提示臭牡丹含藥血清可以有效抑制MHCC97-H肝癌細胞增殖，促進其凋亡并阻止其細胞周期。為進一步探討其抑制肝癌細胞增殖并促進其凋亡的分子機制，我們通過對腫瘤細胞Bax和Bcl-2蛋白表達強度的檢測，發現Bax/Bcl-2蛋白比值呈現上升趨勢（P<0.01），以高劑量組最為明顯。初步提示臭牡丹提取物可能通過提高Bax/Bcl-2蛋白表達水平而促進肝癌細胞凋亡。課題組將更為深入和清晰的探討臭牡丹抗肝癌的具體機制，為其治療肝癌提供更充足的科學依據。

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