復(fù)方雞子黃油膏對(duì)大鼠創(chuàng)面修復(fù)中EGFR、FN、TGF-β1表達(dá)的影響

李艷華 唐智軍 夏鍇 余挽瀾 殷延陵 曹卉 王超 彭裕坤 蔣模威

〔摘要〕 目的 觀察復(fù)方雞子黃油膏對(duì)大鼠創(chuàng)面修復(fù)不同時(shí)期創(chuàng)面組織中表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）、纖維結(jié)合蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）含量及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）表達(dá)的影響。方法 選取雌雄各半實(shí)驗(yàn)大鼠40只，隨機(jī)分為空白組、模型組、龍珠軟膏組（龍珠組）、復(fù)方雞子黃油膏組（雞子黃組），除空白組外，每組予以小面積全層皮膚缺損創(chuàng)面造模，造模成功后各組予以相應(yīng)干預(yù)，連續(xù)14 d，除空白組隨機(jī)取背部皮膚組織外，其他3組均分別于第7、14天取創(chuàng)面組織制作切片并同時(shí)進(jìn)行免疫組化法測(cè)定EGFR、FN、TGF-β1。結(jié)果 治療后第7、14天雞子黃組EGFR、FN、TGF-β1含量均高于其他各組（P<0.05）。結(jié)論 復(fù)方雞子黃油膏通過(guò)提高創(chuàng)面EGFG、FN、TGF-β1的含量促進(jìn)局部組織再生而起修復(fù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕 復(fù)方雞子黃油膏;創(chuàng)面損傷修復(fù);表皮生長(zhǎng)因子受體;纖維結(jié)合蛋白;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R641 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.12.006

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Compound Jizihuang Ointment on expression of epidermal growth factor receptor （EGFR）， fibronectin （FN） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） in the granulation tissue at different stages of a rat model of excisional wound. Methods A total of 20 male and 20 female experimental rats were selected and randomly divided into a blank group， a model group， a Longzhu Ointment group （Longzhu group）， a Compound Jizihuang Ointment （Jizihuang group）. Except the blank group， each group was modeled with a small area full-thickness skin defect wound. After successful modeling， each group was intervened for 14 consecutive days accordingly. For the blank group， the back skin tissue was randomly taken. For the other 3 groups， wound tissue was taken for section at 7 days and 14 days and immunohistochemical method was used to determine EGFR， FN and TGF-β1. Results The expression of EGFR， FN and TGF-β1 of the Jizihuang group at 7 days and 14 days were significantly higher than other groups （P<0.05）. Conclusion Compound Jizihuang Ointment can repair the wound by increasing the content of epidermal growth factor receptor， fibronectin， and transforming growth factor β1 in the wound surface to promote local tissue regeneration.

〔Keywords〕 Compound Jizihuang Ointment; excisional wound healing; epidermal growth factor receptor; fibronectin; transforming growth factor-β1

創(chuàng)傷修復(fù)是指機(jī)體由于外傷或其他原因造成皮膚等組織出現(xiàn)離斷或缺損后，局部組織通過(guò)再生、重建進(jìn)行修補(bǔ)恢復(fù)的一系列病理生理過(guò)程。現(xiàn)代研究證明生長(zhǎng)因子參與調(diào)控創(chuàng)傷修復(fù)的全過(guò)程[1]。我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)如何促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)有著獨(dú)特的理解和豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，尤其是在創(chuàng)面的外治上充分發(fā)揮著中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)。因此，充分發(fā)揮外用中藥有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合的特長(zhǎng)，探討生肌理論，具有重要的意義。復(fù)方雞子黃油膏是我院肛腸科傳統(tǒng)換藥制劑，經(jīng)臨床應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)其能減輕創(chuàng)面疼痛、減少創(chuàng)面滲出、促進(jìn)創(chuàng)面愈合[2]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究擬通過(guò)建立大鼠機(jī)械創(chuàng)傷模型，觀察復(fù)方雞子黃油膏對(duì)大鼠創(chuàng)面修復(fù)不同時(shí)期局部肉芽組織中表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor， EGFR）、纖維結(jié)合蛋白（fibronectin， FN）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transf？鄄orming growth factor-β1，TGF-β1）含量的影響，從分子水平探討復(fù)方雞子黃油膏促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的部分機(jī)制，為該方劑今后的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD大鼠，雌雄各半，質(zhì)量為200～300 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 ?藥品與試劑

復(fù)方雞子黃油膏（由本院制劑室提供，其處方由雞子黃、麻油、煅石膏、血竭等8味中藥組成，并按一定配比、特定方法熬制而成。規(guī)格：20 g/盒）;龍珠軟膏（武漢馬應(yīng)龍股份有限公司規(guī)格：15 g/支，批號(hào)：170203）。ELISA試劑盒購(gòu)自江蘇晶美生物科技有限公司。

1.3 ?主要儀器

JJ-12J脫水機(jī)：武漢俊杰電子有限公司;JB-P5包埋機(jī)：武漢俊杰電子有限公司;D1008E掌上離心機(jī)：谷歌生物;RM2016病理切片機(jī)：上海徠卡儀器有限公司;凍臺(tái)：武漢俊杰電子有限公司。

1.4 ?造模及干預(yù)

1.4.1 ?動(dòng)物造模[3]與分組 ?雌雄各半實(shí)驗(yàn)大鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組：空白組（不造模，不予任何藥物干預(yù)）、模型組（僅造模，不予任何藥物干預(yù)）、龍珠軟膏組（龍珠組）、復(fù)方雞子黃油膏組（雞子黃組）。除空白組外，所有動(dòng)物造模前1天，在大鼠的背部，用電剃刀備皮，剃毛面積約為7 cm×4 cm。次日，使用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功后在脫毛處常規(guī)消毒，選擇背中部脊柱兩側(cè)各旁開(kāi)1 cm，距肩胛骨以下2 cm處制備創(chuàng)面，用創(chuàng)傷制作器切割兩個(gè)直徑約為18 mm圓形創(chuàng)口，深及皮下深筋膜層，形成機(jī)械創(chuàng)傷動(dòng)物模型。

1.4.2 ?干預(yù) ?除空白組及模型組外，各組均勻涂相應(yīng)藥膏0.5 mm厚于創(chuàng)面上，再以無(wú)菌紗布覆蓋，布膠帶“#”形固定，每日換藥1次，至造模成功后第14天。

1.5 ?樣本的制備

除空白組外，每組動(dòng)物造模成功后第7天、第14天分別取左側(cè)、右側(cè)背部創(chuàng)面以愈合創(chuàng)面中心為圓點(diǎn)直徑18 mm的圓形組織，空白組隨機(jī)取相應(yīng)部位同樣大小背部皮膚組織，同批4組標(biāo)本每塊組織均勻分成2份，一份制作組織勻漿，另一份用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚5 μm。

1.6 ?指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 ?皮膚組織形態(tài)學(xué)觀察 ?觀察各組創(chuàng)面治療后外觀，拍照時(shí)相機(jī)距離創(chuàng)面約8 cm。

1.6.2 ?酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）法EGFR、FN、TGF-β1檢測(cè) ?制作組織勻漿后的樣本，采用ELISA法檢測(cè)EGFR、FN、TGF-β1濃度，按試劑盒操作步驟進(jìn)行。

1.6.3 ?免疫組化法EGFR、FN、TGF-β1檢測(cè) ?福爾馬林固定，石蠟包埋切片后樣本進(jìn)行免疫組化染色程序后封片，顯微鏡檢并圖像采集，圖像分析EGFR、FN、TGF-β1信號(hào)表達(dá)強(qiáng)度。免疫組化結(jié)果測(cè)定：陽(yáng)性染色為棕色顆粒，定位于胞漿和/或胞膜。顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，觀察每個(gè)視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。

1.7 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料“x±s”表示，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性及方差齊性時(shí)用單因素方差分析的方法，多組之間的比較采用Dunnett′s檢驗(yàn)進(jìn)行組間的兩兩比較，方差不齊時(shí)采用校正t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?造模成功動(dòng)物數(shù)量

實(shí)驗(yàn)共使用SD大鼠40只，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物無(wú)死亡，實(shí)驗(yàn)樣本全部納入結(jié)果分析。

2.2 ?皮膚組織形態(tài)學(xué)觀察

大體觀察見(jiàn)雞子黃組大鼠創(chuàng)面基本愈合，龍珠組大鼠創(chuàng)面縮小，模型組大鼠創(chuàng)面愈合緩慢。見(jiàn)圖1。

2.3 ?各組大鼠創(chuàng)面組織中不同時(shí)相點(diǎn)EGFR、FN、TGF-β1的表達(dá)情況

2.3.1 ?ELISA法分析 ?除空白組外，各組創(chuàng)面組織中EGFR、FN、TGF-β1表達(dá)均逐漸上升，組內(nèi)比較，第14天均高于第7天（P<0.05）;模型組高于空白組（P<0.05）;龍珠組、雞子黃高于模型組（P<0.05），雞子黃組高于龍珠組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.3.2 ?免疫組化法分析 ?免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性區(qū)域表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色沉淀，在第7、14天，各組創(chuàng)面組織中EGFR、FN、TGF-β1表達(dá)水平：雞子黃組>龍珠組>模型組>空白組。見(jiàn)圖2-4。

3 討論

由于致傷物機(jī)械力的作用而使人體產(chǎn)生的器官組織結(jié)構(gòu)的破壞和（或）功能障礙稱為機(jī)械性損傷，機(jī)械性損傷最常見(jiàn)于皮膚，皮膚損傷后，創(chuàng)面愈合慢，可能導(dǎo)致感染，甚至癌變，因此，加速創(chuàng)面愈合不僅可以減少感染機(jī)會(huì)，而且可以減少患者痛苦。

EGFR是表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員之一，在細(xì)胞生理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。目前有實(shí)驗(yàn)研究表明皮膚愈合過(guò)程中表皮生長(zhǎng)因子（epidermalgrowthfactor， EGF）對(duì)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)起主導(dǎo)作用，對(duì)創(chuàng)面愈合中后期的再上皮化有著特殊效果，同時(shí)還可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的非膠原性蛋白合成，選擇性抑制Ⅰ型膠原產(chǎn)生，促進(jìn)傷口愈合[4-7]。

FN具有特別的分子結(jié)構(gòu)，對(duì)膠原、肌動(dòng)蛋白、纖維和其它分子有很高的親合能力，它不僅可以協(xié)助網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除異物，而且可以在創(chuàng)口愈合中與膠原和纖維連接而決定傷口的關(guān)閉和（或）愈合[8]。FN具有粘性吸附的作用，可以包裹部分細(xì)菌及組織碎片并由巨噬細(xì)胞消化，加速機(jī)體清除傷口內(nèi)異物，還可以作為移行細(xì)胞接觸的臨時(shí)基質(zhì)，另外，F(xiàn)N先于膠原物質(zhì)沉積于傷口并使傷口收縮，成為明膠基質(zhì)的骨架，加速傷口愈合。

TGF-β1作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子中的一員，在創(chuàng)面修復(fù)中起重要作用。它作為成纖維細(xì)胞最強(qiáng)的趨化因子，在促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、遷徙、分化中起重要作用，TGF-β1趨化成纖維細(xì)胞向基底遷徙增殖，促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白及纖維連接蛋白形成臨時(shí)的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix， ECM），從而促進(jìn)肉芽組織形成[9]。TGF-β1趨化上皮細(xì)胞分裂增殖，增加角化細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，利于完整上皮覆蓋及膠質(zhì)沉積[10]。同時(shí)，可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子等作用的發(fā)揮，從而間接促進(jìn)新生血管形成[11]。

研究結(jié)果顯示，經(jīng)龍珠軟膏及復(fù)方雞子黃油膏涂搽治療14 d的機(jī)械創(chuàng)傷大鼠其創(chuàng)面近愈合，而模型組創(chuàng)面愈合差，與模型組及空白組比較，龍珠軟膏組及復(fù)方雞子黃油膏組創(chuàng)面組織中EGFR、FN、TGF-β1表達(dá)均增加，而復(fù)方雞子黃油膏組增加更為明顯。

復(fù)方雞子黃油膏是湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德醫(yī)院肛腸科傳統(tǒng)換藥制劑，通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證實(shí)，復(fù)方雞子黃油膏可以提高創(chuàng)面EGFR含量，從而增加其與EGF的結(jié)合，促進(jìn)非膠原性蛋白合成。復(fù)方雞子黃油膏同時(shí)提高FN和TGF-β1的表達(dá)，利用FN的粘附特性構(gòu)建基質(zhì)骨架，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖分化，形成肉芽組織，促進(jìn)傷口愈合。但是，EGFR、FN、TGF-β1只是眾多復(fù)雜信號(hào)通路中的一部分，且本研究在大鼠創(chuàng)面愈合的整個(gè)過(guò)程中僅選擇了2個(gè)時(shí)相點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)本采集和檢測(cè)，不能完全闡述完整的創(chuàng)面愈合過(guò)程，且未行HE染色，因此，有關(guān)復(fù)方雞子黃油膏促愈的具體作用機(jī)制，仍需從完整的信號(hào)通路及病理等方面進(jìn)一步研究探討。

參考文獻(xiàn)

[1] YOUNG A， MCNAUGHT C E. The physiology of wound healing[J]. Surgery （Oxford），2011，29（10）：475-479.

[2] 唐智軍，劉 ?淳，孔祥建，等.復(fù)方蛋黃油膏對(duì)低位單純性肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合影響的臨床研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（10）：12-14，23.

[3] 趙京禹，付小兵，雷永紅.大鼠小面積全層皮膚缺損創(chuàng)面模型的制備[J].創(chuàng)傷、炎癥、修復(fù)，2008，9（1）：64.

[4] 羅肇林，梁自乾.表皮生長(zhǎng)因子受體在糖尿病性創(chuàng)面修復(fù)中的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2008，14（5）：721-723.

[5] BEMIER J， BONNER J， VERMORKEN J B， et al. Consensus guidelines for the management of radiation dermatitis and coexisting acne-like rash in patients receiving radiotherapy plus EGFR inhibitors for the treatment of squamous cell carcinoma of the head and neck[J]. Annals of Oncology， 2008，19（1）：142-149.

[6] WOLLENBERG A， KROTH J， HAUSCHILD A. Cutaneous side effects of EGFR inhibitors-appearance and management.[J]. Deutsche Medizinische Wochenschrift， 2010，135（4）：149-154.

[7] THULA T T， SCHULTZ G， TRAN-SON-TAY R， et al. Effects of EGF and bFGF on Irradiated Parotid Glands[J]. Annals of Biomedical Engineering， 2005，33（5）：685-695.

[8] 肖 ?赫，李雅嘉，王 ?華，等.纖維連接蛋白在糖尿病足潰瘍中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2017，11（37）：5474-5475.

[9] DEMIDOVA-RICE T N， HAMBLIN M R， HERMAN I M. Acute and Impaired Wound Healing[J]. Advances in Skin & Wound Care， 2012， 25（7）：304-314.

[10] 王少霞，任俊輝，楊蕾蕾，等.皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中TGF-β1及膠原表達(dá)變化的定量研究[J].中國(guó)體視學(xué)與圖像分析，2015，20（1）：58-67.

[11] 武 ?姍.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β及其受體在糖尿病足創(chuàng)面愈合過(guò)程中作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)糖尿病雜志，2017，25（6）：569-572.