凋萎時間對多花黑麥草青貯品質及微生物動態變化的影響

牟林林　宦海琳　許能祥　丁成龍　顧洪如

摘要：【目的】研究凋萎時間對多花黑麥草青貯發酵品質及其微生物動態變化的影響，明確多花黑麥草適宜的凋萎時間，為后續研究和生產提供科學依據。【方法】以抽穗期多花黑麥草為原料，設對照（CK，水分含量78.16%）、凋萎2 h（W2，水分含量69.18%）、凋萎4 h（W4，水分含量62.09%）和凋萎6 h（W6，水分含量53.03%）4個處理，監測青貯過程中原料的微生物動態變化，測定青貯49 d開袋后青貯料的飼用價值和發酵品質。【結果】凋萎2 h和4 h處理的青貯樣品感官評定優良，對照和凋萎6 h處理的感官評定尚好或中等。凋萎處理可顯著提高青貯干物質、水溶性碳水化合物含量和pH（P<0.05，下同），顯著降低丁酸含量和氨態氮/總氮（NH4+-N/TN）比例。凋萎2 h對青貯有機酸（乳酸、乙酸和丙酸）含量無顯著影響（P>0.05），凋萎4 h和6 h的有機酸含量顯著下降。與對照相比，3個凋萎處理原料（青貯0 d）微生物數量顯著減少;青貯過程中，對照和凋萎2 h處理的青貯乳酸菌增幅較大，且霉菌數量降幅較大。水分含量與乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量、NH4+-N/TN比例及乳酸菌數量呈極顯著正相關（P<0.01，下同），與pH、乙醇含量和霉菌數量呈極顯著負相關。【結論】綜合發酵品質及微生物數量動態變化認為，凋萎2 h（水分含量70%左右）的多花黑麥草原料單獨青貯品質最佳。

關鍵詞： 多花黑麥草;凋萎;微生物動態變化;發酵品質

中圖分類號：S816.53? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）12-2771-07

Effects of wilting time on fermentation quality and microbial dynamics of Italian ryegrass silage

MU Lin-lin， HUAN Hai-lin， XU Neng-xiang， DING Cheng-long， GU Hong-ru*

（Institute of Animal Science， Jiangsu Academy of Agricultural Science/key Laboratory of Crop and

Animal Integrated Farming， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanjing? 210014， China）

Abstract：【Objective】To study the effects of different wilting times on the fermentation quality and microbial dyna-mics in Italian ryegrass silage. The appropriate withering time was determined to provide scientific basis for follow-up research and production. 【Method】The Italian ryegrass was ensiled with no wilting control（CK， water content of 78.16%）， wilting 2 h（W2， water content of 69.18%）， wilting 4 h（W4， water content of 62.09%），wilting 6 h（W6， water content of 53.03%）. The microbial dynamics of materials in silage process were monitored， and fermentation quality characteristics of silage after 49 d were determined. 【Result】The results indicated that the silage samples treated with 2 and 4 h of wilting were evaluated as excellent， while the silage samples treated with 6 h of wilting and the control group were evalua-ted as good or medium. Wilting treatment could significantly increase the content of dry matter， water-soluble carbohydrate and pH value of silage（P<0.05， the same below）， significantly reduced the content of butyric acid and the ratio of ammoniacal nitrogen/total nitrogen（NH4+-N/TN）. The content of organic acids（lactic acid， acetic acid， propionic acid） in silage was not significantly affected by wilting for 2 h（P>0.05）， and those under wilting 4 h and 6 h was decreased signi-ficantly. Compared with CK group， the microbial quantity of raw materials in three wilting treatments（silage for 0 d） was significantly reduced. During silage， lactic acid bacteria increased significantly in CK and W2 groups， and the number of molds decreased greatly. Water content was extremely positively correlated with lactic acid， acetic acid， propionic acid ，butyric acid content， NH4+-N/TN ratio and lactic acid bacteria quantity（P<0.01， the same below）， and extremely negatively correlated with pH value， ethanol content and mold quantity. 【Conclusion】 According to the fermentation quality and the dynamic changes of microbial quantity， the silage quality of Italian ryegrass in group W2 wilting for 2 h， namely a moisture content of about 70%， is the best.

Key words： Italian ryegrass; wilting; microbial community dynamics; fermentation quality

0 引言

【研究意義】多花黑麥草具有產草量高、營養豐富、質地柔軟、畜禽喜食等特點，且耐濕能力強，與作物爭地、爭季節的矛盾小，常作為牧草在南方地區稻茬冬閑田種植。多花黑麥草種植面積占江蘇農區冬季牧草面積的80%以上，其產草集中在高溫多雨季節，調制青干草較困難（鄭凱，2006），因此青貯是較理想的保存方式。但多花黑麥草鮮草水分含量較高，直接青貯易產生大量滲出液，引起丁酸型發酵，導致青貯失敗。已有研究表明，青貯原料水分含量對青貯發酵品質有一定影響（李君臨等，2014;關皓，2016），且青貯環境中水分含量同樣會影響微生物活動。因此，掌握凋萎對多花黑麥草青貯微生物動態變化的影響十分必要。【前人研究進展】青貯過程中參與活動的微生物很多，主要分為有益微生物和有害微生物兩類。有益微生物：同型發酵乳酸菌主要產生乳酸，能迅速降低pH，抑制梭菌發酵;異型發酵乳酸菌發酵糖產生乳酸、乙酸和乙醇等，有利于維持青貯料的有氧穩定性（蔡義民等，1995;塔娜等，2017）。有害微生物：耗氧細菌、霉菌和梭菌等。耗氧細菌一般分解蛋白質和氨基酸，產生NH3;霉菌易分解糖和乳酸，導致青貯料有氧腐敗;梭菌在厭氧的狀態下生長，能分解糖、有機酸和蛋白質，產生丁酸及氨等物質，導致青貯腐敗（張大偉等，2007;張適等，2017）。劉桂要（2009）研究發現，厭氧環境可顯著抑制玉米原料中霉菌的生長和增殖;張慧杰（2011）的研究結果表明，隨著水分含量的降低，苜蓿青貯的乳酸菌數量逐漸減少;關皓（2016）的研究也得出類似結論，低水分多花黑麥草青貯后會降低乳酸菌活性;Bao等（2016）認為發酵品質良好的青貯飼料應具有更高的乳酸菌含量和更低的霉菌、梭菌等有害微生物;鄭明利（2017）研究發現，隨苜蓿原料水分含量的降低，梭菌活動被顯著抑制;劉蓓一等（2018）在關于多花黑麥草與稻秸混貯試驗中發現，當多花黑麥草與稻秸比例為6∶4或7∶3時青貯過程中的乳酸菌數量顯著高于比例為8∶2或9∶1的乳酸菌數量。【本研究切入點】目前，有關青貯原料水分含量對青貯發酵品質影響的研究較多，但針對原料水分含量對多花黑麥草青貯微生物動態變化的影響研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】探究凋萎時間對多花黑麥草青貯微生物數量動態變化及發酵品質的影響，確定多花黑麥草適宜的凋萎時間，為后續研究和生產提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

多花黑麥草頭茬抽穗期刈割，刈割后分別凋萎0、2、4和6 h，凋萎后水分含量分別為78.16%、69.18%、62.09%和53.03%。原料成分見表1。主要儀器設備：高速萬能粉碎機（FW100，天津泰斯特儀器有限公司）;KjeltecTM 2300型全自動凱氏定氮儀（丹麥福斯分析儀器公司）;高效液相色譜儀（安捷倫1260型，德國安捷倫科技有限公司）;Carbomix? H-NP5色譜柱（流動相為2.5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，溫度55 ℃，美國賽分科技有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 試驗設計 試驗于2017年4月27日在江蘇省農業科學院六合試驗基地進行。采用單因素完全隨機設計，設4個處理，分別為對照（CK，水分含量78.16%）、凋萎2 h（W2，水分含量69.18%）、凋萎4 h（W4，水分含量62.09%）和凋萎6 h（W6，水分含量53.03%），每處理設24次重復。將多花黑麥草切短至2～3 cm，混勻后稱取300 g裝入40 cm×30 cm聚乙烯袋內，利用真空封口機抽氣封口，置于室溫避光條件下保存。分別在青貯0、1、3、5、7、14、21、35和49 d隨機取3袋打開，樣品混勻后分析青貯飼料微生物動態變化，并在第49 d取樣分析青貯料的營養成分和發酵品質。

1. 2. 2 樣品處理 青貯49 d后開袋取樣，將青貯料充分混勻后，稱取20 g青貯飼料置于三角瓶中，加入180 g去離子水，攪拌均勻，于4 ℃下浸提24 h，之后用4層紗布和定性濾紙過濾，得到浸提液，置于 -20 ℃冰箱保存待測。浸提液用于測定pH、氨態氮（NH4+-N）、乳酸（Lactic acid，LA）、乙酸（Acetic acid，AA）、丙酸（Propionic acid，PA）、丁酸（Butyric acid，BA）和乙醇含量。另取10 g樣品，加入90 mL 0.9%無菌生理鹽水，封口膜封口，用于耗氧細菌、乳酸菌和霉菌計數。收集剩余的青貯料，于105 ℃殺青15 min，然后75 ℃烘箱中烘干48 h以上至恒重，測定干物質（Dry matter，DM）含量，將烘干樣品用高速萬能粉碎機粉碎，過1 mm篩，放入聚乙烯自封袋中，排盡空氣密封保存，用于測定粗蛋白（Crude protein，CP）、水溶性碳水化合物（Water-soluble carbohydrates，WSC）、中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）等化學成分。

1. 3 測定項目及方法

1. 3. 1 感官評價 根據德國農業協會青貯質量感官評分標準評定青貯質量（Hristov and Sandev，1998）。

1. 3. 2 營養成分 青貯料中WSC含量采用蒽酮—硫酸比色法（Owens et al.，1999）測定，CP和總氮（Total nitrogen，TN）含量采用凱氏定氮法測定，NDF和ADF含量采用Van-soest法應用濾袋技術測定。

1. 3. 3 發酵指標 pH采用Micro-Bench型pH計直接測定;青貯料中NH4+-N含量采用苯酚—次氯酸鈉比色法測定;乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和乙醇含量采用高效液相色譜儀測定，配備示差檢測器和Carbomix? H-NP5色譜柱。

1. 3. 4 微生物計數 采用平板培養法進行微生物計數。用0.9%無菌生理鹽水進行梯度稀釋，選擇2個合適的梯度涂板，每個梯度3次重復。耗氧細菌、乳酸菌和霉菌分別采用營養肉湯瓊脂培養基、MRS肉湯瓊脂培養基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基培養計數。

1. 4 統計分析

采用Excel 2010對試驗數據進行預處理，SPSS 19.0進行方差分析和Spearman相關性分析。

2 結果與分析

2. 1 感官評價結果

不同凋萎時間對多花黑麥草青貯料感官評價的影響見表2。在青貯結束后，依據青貯標準對不同凋萎時間的青貯樣品進行感官評定，結果發現，W2和W4處理的青貯樣品感官評定為優良，CK的感官評定為尚好，W6處理的感官評定為中等。

2. 2 凋萎時間對多花黑麥草青貯料營養成分的影響

不同凋萎時間對多花黑麥草青貯料營養成分含量的影響見表3。隨著凋萎時間的延長，青貯料DM含量顯著增加（P<0.05，下同），W6處理的含量最高，為43.48%;青貯料WSC含量除W2處理外總體上呈上升趨勢，各處理間WSC含量差異顯著;青貯料CP含量有所降低，但各處理間差異不顯著（P>0.05，下同）;CK與3個凋萎處理的NDF和ADF含量差異均不顯著。

2. 3 凋萎時間對多花黑麥草青貯料發酵品質的影響

由表4可知，隨著凋萎時間的延長，青貯料pH逐漸升高，凋萎處理的pH與CK間差異顯著;乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量及NH4+-N/TN比例總體上呈下降趨勢，乙醇含量呈顯著上升趨勢。與CK相比，W2處理的乳酸、乙酸和丙酸含量無顯著變化，而W4和W6處理的乳酸、乙酸和丙酸含量變化幅度較大，與CK差異顯著;與CK相比，3個凋萎處理的丁酸含量均顯著減少，且凋萎時間越長，丁酸含量下降幅度越大;凋萎2～6 h，NH4+-N/TN比例降低，與CK間差異顯著，但3個凋萎處理間差異不顯著。

2. 4 凋萎時間對多花黑麥草青貯料微生物動態變化的影響

2. 4. 1 耗氧細菌動態變化 由表5可知，凋萎顯著減少原料自身耗氧細菌數量。在整個青貯過程中，所有處理的耗氧細菌變化趨勢一致，青貯前期耗氧細菌數量迅速增加，之后逐漸下降直至青貯結束，CK和W2處理的耗氧細菌數量低于青貯前耗氧細菌數量，W4和W6處理則高于青貯前耗氧細菌數量。青貯1 d，CK的耗氧細菌數量達最大值（9.14 lg CFU/gFW），3個凋萎處理的耗氧細菌數量仍呈上升趨勢;青貯5 d，W2、W4和W6處理的耗氧細菌數量均達最大值，分別為9.33、9.50和8.52 lg CFU/gFW，CK的耗氧細菌數量降至7.85 lg CFU/gFW。隨著凋萎時間的延長，各處理的耗氧細菌數量緩慢下降，至青貯結束（49 d）時，3個凋萎處理的耗氧細菌數量均顯著高于CK，但W4和W6處理間差異不顯著。

2. 4. 2 乳酸菌動態變化 從表6可看出，延長凋萎時間，青貯料自身的乳酸菌數量顯著下降。在整個青貯過程中，青貯前期乳酸菌數量呈上升趨勢，青貯后期則呈下降趨勢;其中，W2處理的乳酸菌數量增加幅度最大，其次是CK和W4處理。青貯7 d，W6處理的乳酸菌數量達最大值（6.06 lg CFU/gFW）;青貯14 d，CK的乳酸菌數量達最大值（8.73 lg CFU/gFW）;青貯21 d，W2和W4處理的乳酸菌數量達最大值，分別為8.22和7.71 lg CFU/gFW。至青貯結束（49 d）時，CK和3個凋萎處理乳酸菌數量分別為7.84、7.92、6.87和5.51 lg CFU/gFW，W4和W6處理與CK差異顯著。

2. 4. 3 霉菌動態變化 由表7可知，延長凋萎時間能顯著減少青貯前（0 d）原料霉菌數量。青貯后，隨著青貯時間的延長，CK與3個凋萎處理的霉菌數量均呈下降趨勢。至青貯結束（49 d）時，CK和W2處理的霉菌數量下降幅度最大，數量分別減少2.65和2.06 lg CFU/gFW;W4和W6處理的霉菌數量下降幅度較小，數量分別減少1.08和0.43 lg CFU/gFW。青貯期間，各凋萎處理的霉菌數量與CK均存在顯著差異。

2. 5 水分含量與青貯料品質指標及微生物數量的Spearman相關性分析結果

根據Spearman相關性分析結果（表8）可發現，水分含量與pH、乙醇含量和霉菌數量呈極顯著負相關（P<0.01，下同），凋萎時間越長，水分含量越低，pH和乙醇含量越高，霉菌數量越多;水分含量與有機酸（乳酸、乙酸、丙酸和丁酸）含量、NH4+-N/TN比例和乳酸菌數量呈極顯著正相關，水分含量越低，有機酸含量越低，NH4+-N/TN比例越小，乳酸菌數量越少;水分含量與耗氧細菌數量無顯著相關性。

3 討論

3. 1 凋萎時間對多花黑麥草青貯料感官品質的影響

本研究結果表明，凋萎2 h和4 h處理的青貯料感官色澤與青貯原料色澤相近，但凋萎4 h的青貯料聞起來酸香味不如凋萎2 h芳香;對照青貯料有較刺鼻酸味且有黏膩感。說明適當凋萎有利于提高多花黑麥草原料的發酵品質，但過度凋萎青貯（凋萎6 h）無明顯發酵氣味，稍有霉味，發酵品質反而下降。

3. 2 凋萎時間對多花黑麥草青貯料品質的影響

Gordon等（2000）曾指出，植物細胞液的釋放是天然厭氧發酵開始的前提;干物質濃度超過333 g/kg時，發酵效果明顯下降。本研究結果表明，多花黑麥草經凋萎處理后，青貯料的WSC含量總體呈上升趨勢，而凋萎2 h處理的青貯料WSC含量較低，究其原因可能是凋萎導致含水率下降，WSC成分相對濃縮，提高了乳酸菌對底物的利用效率，乳酸菌利用更多WSC，導致凋萎2 h處理的青貯料剩余WSC含量較少（劉輝等，2015）。本研究結果還表明，隨凋萎時間的延長，青貯料中CP、NDF和ADF含量差異不顯著。余汝華等（2007）、郭天龍（2009）的研究結果也表明，凋萎處理不影響玉米青貯料和甜菜莖葉青貯的CP、NDF、ADF等營養成分。本研究中，隨著凋萎時間的延長，與對照相比，凋萎處理的青貯料pH顯著上升，凋萎4 h和6 h青貯料中乳酸和乙酸含量顯著減少，而凋萎2 h對乳酸和乙酸含量無顯著影響。其原因可能是凋萎使青貯料干物質含量增加，植物細胞液釋出減少，從而減少發酵底物，抑制乳酸發酵。青貯飼料中NH4+-N含量是評定青貯飼料質量的重要指標。凋萎能抑制蛋白質降解，特別是能夠抑制氨基酸進一步降解脫氨（鄭明利，2017）。本研究中，凋萎2 h即可顯著減小NH4+-N/TN比例，與孔凡德（2002）凋萎多花黑麥草試驗結論一致。乙醇含量隨凋萎時間的延長而顯著增加，可能是當原料干物質在50%左右時青貯發酵以乙醇發酵為主，而非乳酸發酵（管武太等，2002）。

3. 3 凋萎時間對多花黑麥草青貯料微生物動態變化的影響

凋萎青貯是在原料刈割后晾曬預干，使水分降至40%～60%時再進行青貯，萎蔫后植物細胞液變濃，滲透壓增高，造成微生物的生理干燥狀態，且在厭氧條件下微生物發酵作用被抑制，從而達到保存養分的目的（李志強，2002）。本研究中，凋萎時間越長，青貯前期耗氧細菌活動時間越長，可能是凋萎處理后水分減少，莖中空使得青貯時空氣含量增多，導致耗氧細菌活動時間延長。青貯后期，對照和凋萎處理的青貯料耗氧細菌數量均減少，凋萎2 h相對于凋萎4 h和6 h的耗氧細菌數量少。水分含量是影響青貯成敗的關鍵因素之一，與耗氧細菌相比，梭菌更容易受到水分活度的影響（Tremblay et al.，2001）。本研究中，丁酸含量和NH4+-N/TN比例與水分含量呈極顯著正相關，即水分含量越高，丁酸含量和NH4+-N/TN比例越高，因此，可能是梭菌發酵引起對照青貯料中丁酸含量和NH4+-N/TN比例高于凋萎處理的青貯料。

青貯質量的優劣取決于乳酸菌作用，而乳酸是乳酸菌主要的代謝產物（Kung et al.，2000）。有研究表明，當干物質含量大于450 g/kg時，乳酸菌繁殖力和代謝能力明顯減弱（楊云貴等，2012）。本研究中，凋萎處理減少了植物自身附著乳酸菌數量，乳酸菌數量與水分含量呈極顯著正相關，凋萎時間越長，水分含量越低，乳酸菌數量越少，越不利于乳酸菌發酵。Wang等（2018）對辣木葉凋萎青貯的研究發現，乳酸菌屬在未凋萎處理的青貯中占優勢，在凋萎試驗組中腸桿菌屬和片球菌屬是優勢菌群，凋萎時間的延長，顯著抑制了乳酸菌在青貯過程中的增殖。在本研究的整個青貯發酵進程中，凋萎2 h的青貯料中乳酸菌數量始終高于凋萎4 h和6 h，即凋萎2 h更適宜乳酸菌發酵。

凋萎處理可減少多花黑麥草原料附著霉菌數量，水分含量與霉菌數量呈極顯著負相關。在青貯過程中，對照和凋萎2 h的霉菌數量下降幅度較大，凋萎4 h和6 h的霉菌數量下降幅度較小，可能是凋萎4 h和6 h的青貯料水分含量過低，微生物活動導致青貯pH偏高，因此無法有效降低霉菌數量。此外，這兩個處理的乳酸菌含量少，pH在青貯前期未快速下降，不能快速抑制霉菌生長、繁殖。雖然凋萎4 h和6 h在密封條件下不會導致青貯腐敗，可一旦青貯料開袋，氧氣進入，霉菌會大量繁殖，成為優勢菌，影響開袋后的有氧穩定性，導致青貯料有氧腐敗（周斐然，2017）。

4 結論

當水分含量在70%左右時，青貯中乳酸含量較高，丁酸含量和NH4+-N/TN比例較低，乳酸菌數量高而霉菌數量低。因此，綜合發酵品質及微生物數量動態變化認為，W2組即水分含量在70%左右的多花黑麥草原料單獨青貯品質最佳。

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（責任編輯 羅 麗）