赤水烏骨雞TYR基因多態性及生物信息學分析

祖盤玉　李維　林家棟　李洪林　劉洋　牟騰慧　龍廣麗　簡華峰　張福平

摘要：【目的】找出赤水烏骨雞和泰和烏雞TYR基因外顯子的多態位點（SNP），為后期利用分子遺傳學技術選育烏度更深的赤水烏骨雞提供參考依據。【方法】采用DNA混池結合PCR產物直接測序法，分析赤水烏骨雞和泰和烏雞TYR基因外顯子的SNP位點，并對篩選出的SNP位點進行生物信息學分析。【結果】在泰和烏雞中發現4個SNPs位點，分別為Exon1-C829T、Exon1-C921T、Intron1-A1018G和Intron2-T79A，其中，Exon1-C829T和Exon1-C921T為同義突變;在赤水烏骨雞中發現5個SNPs位點，分別為Intron1-G156A、Intron2-T7C、Intron4-G201A、Intron4-C221T和Exon5-A205G（非編碼區）。利用在線生物信息學分析軟件對TYR基因突變前后編碼區序列的mRNA二級結構進行預測分析，結果發現赤水烏骨雞的mRNA二級結構未發生變化，而泰和烏雞Exon1-C829T和Exon1-C921T的突變均引起mRNA二級結構改變，使得TYR基因mRNA二級結構最小自由能減小，即二級結構穩定性增加。赤水烏骨雞TYR蛋白二級結構由α-螺旋、無規則卷曲、β-轉角及擴展鏈組成，分別占26.65%、55.31%、3.41%和14.63%。【結論】Exon1-C921T突變可能會對雞的肉色產生影響，故推測Exon1-C921T是影響赤水烏骨雞和泰和烏雞烏度差異的原因之一。

關鍵詞： 赤水烏骨雞;泰和烏雞;TYR基因;SNP位點;生物信息學

中圖分類號： S831.89 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）12-2806-06

Polymorphism and bioinformatics analysis of TYR gene in Chishui Black-bone Chicken

ZU Pan-yu1， LI Wei2， LIN Jia-dong1， LI Hong-lin1， LIU Yang1， MOU Teng-hui1，

LONG Guang-li1， JIAN Hua-feng1， ZHANG Fu-ping1*

（1College of Animal Sciences， Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region， Ministry of Education/Guizhou Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction， Guiyang? 550025， China; 2Guizhou Management Station of Livestock Genetic Resources，

Guiyang? 550001， China）

Abstract：【Objective】To find the polymorphic loci（SNP） of exon of TYR gene from Chishui Black-bone Chicken and Taihe Silky Fowl， and lay a foundation for the later cultivation of Chishui Black-bone Chicken with deeper Wudu by molecular genetics technology. 【Method】The TYR gene exon SNPs of Chishui black-bone chicken and Taihe Silky Fowl were analyzed by DNA pooling and direct sequencing of PCR products， and bioinformatics analysis on SNP selected was conducted. 【Result】It was found that there were four SNPs in Taihe Silky Fowl， namely：Exon1-C829T， Exon1-C921T， Intron1-A1018G， Intron2-T79A， among which Exon1-C829T and Exon1-C921T were synonymous mutations. Five SNPs were found in Chishui Black-bone Chicken， they were Intron1-G156A， Intron2-T7C， Intron4-G201A， Intron4-C221T， Exon5-A205G（non-coding region）. The bioinformatics analysis software was used to analyze the mRNA secondary structure of coding region of TYR gene before and after mutation. It was found that mRNA secondary structure of Chishui Black-bone Chicken did not change， but both Taihe Silky Fowl Exon1-C829T and Exon1-C921T caused changes in the secondary structure of mRNA， which resulted in the minimum free energy of the secondary structure of TYR gene mRNA， that was， the stability of the secondary structure increases. TYR protein secondary structure of Chishui Black-bone Chicken was consisted of α-helix， random coil， β-turn and extended chain which accounted for 26.65%， 55.31%， 3.41% and 14.63%. 【Conclusion】Exon1-C921T mutation may change the color of chicken meat. Exon1-C921T may be one of the reasons that affect the difference between Chishui Black-bone Chicken and Taihe Silky Fowl.

Key words： Chishui Black-bone Chicken; Taihe Silky Fowl; TYR gene; SNPs; bioinformatics

0 引言

【研究意義】赤水烏骨雞是貴州省優良的肉蛋兼用型地方品種，具有抗潮濕、體型較大、耐熱耐粗飼料、覓食能力強、生長速度快、肉質鮮美及營養成分豐富等優良特性（李思，2015），但與泰和烏雞相比，其皮膚、胸肌、腿肌、舌頭和骨膜的烏度均較淺。烏骨雞的藥用價值與其烏度（黑色素含量）密切相關（徐幸蓮等，1999;鄭從義等，1999），目前消費者對烏骨雞品質的判斷也都是基于其烏度。烏骨雞的烏度與真黑色素和脫黑色素的含量有關，當真黑色素含量較高時，其皮膚呈褐色或黑色，若脫黑色素含量較高則呈黃色（Ito et al.，2000）。黑色素的合成速率及其合成量又與酪氨酸酶（TYR）密切相關（劉青等，2018），即TYR是催化酪氨酸合成真黑色素和脫黑色素的關鍵酶，TYR基因突變會引起其活性改變，進而影響組織黑色素沉積，最終促使哺乳動物被毛或家禽羽色及膚色白化（Tsai et al.，1999）。因此，研究TYR基因外顯子多態性對進一步揭示烏骨雞黑色素沉積規律及選育烏度更深的烏骨雞具有重要意義。【前人研究進展】近年來的研究表明，TYR基因不僅影響動物的毛色，還對哺乳動物、魚類及禽類的體色產生影響。在哺乳動物上，王斌等（2006）研究發現，白猴色素變化與TYR基因的多態雜合突變有關;Kausar等（2013）發現綿陽TYR基因C位點突變導致TYR發生功能性缺陷，進而影響黑色素合成。此外，TYR基因突變會導致眼睛、皮膚及毛發缺乏黑色素，即白化病（Arveiler et al.，2017）。Yoshimura等（2000）研究發現，攜帶TYR基因G308C突變的轉基因小鼠無色素沉著，易發生白化病;孫婉（2017）在人類TYR基因編碼區發現2個新的錯義突變（W400G和Q273H），經PolyPhen-2預測得知這2個突變可能有害，甚至可能致病;徐盈等（2018）研究發現，眼皮白化病患者的父親TYR基因編碼區發生R116T突變，其母親出現移碼突變c.929insC，而患者這兩種突變均有發生。在魚類上，蔣燕玲（2016）對橘色雙冠麗魚體色進行研究，結果發現在褪色過程中，其TYR基因表達量表現為黑色顯著高于灰色和黃亮色，而灰色和黃亮色的差異不顯著;周愛國（2016）發現烏鱧皮膚組織的TYR基因表達量極顯著高于白甲烏鱧;王良炎（2017）對黃河鯉TYR基因的研究發現，該基因參與黃河鯉體色形成，在黑色皮膚中含量最高，且其表達水平與黑色素細胞數量和分布存在一定相關性。在禽類上，Chang等（2006）、Sato等（2007）研究表明TYR基因外顯子和內含子中的突變可導致雞全身顏色和肉色變化;李國輝等（2012）、Zhang等（2015）研究表明TYR基因不同基因型均會影響雞的肉色，且上調的TYR基因在黑雞中具有更高表達量，推測TYR基因差異表達是影響烏骨雞烏度的主要原因之一。可見，加強TYR基因多態性分析對選育烏度更深的赤水烏骨雞具有重要意義。【本研究切入點】目前，有關家禽TYR基因多態性分析的研究主要集中在第1外顯子、啟動子及組織表達量方面，而針對赤水烏骨雞的研究尚無相關報道。【擬解決的關鍵問題】采用DNA混池結合PCR產物直接測序法，分析赤水烏骨雞和泰和烏雞TYR基因外顯子的多態位點（SNP），并對篩選獲得的SNP位點進行生物信息學分析，旨在找出兩個烏雞品種TYR基因外顯子的差異SNP位點，為后期利用分子遺傳學技術選育烏度更深的赤水烏骨雞提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

赤水烏骨雞和泰和烏雞均由貴州大學科研雞場提供，為相同條件飼養至150日齡的健康雞，在翅下靜脈肝素鈉抗凝采集血樣。瓊脂糖、Taq PCR MasterMix溶液及Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1. 2 基因組DNA提取

采用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，以紫外分光光度計測定總DNA的濃度和純度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，-20 ℃保存備用。

1. 3 引物設計與合成

根據GenBank上已公布的紅色原雞TYR基因序列（GenBank登錄號NC_006088），利用Primer Premier 5.0對TYR基因的5個外顯子（Exon1～Exon5）及部分內含子設計引物，引物詳細信息見表1。

1. 4 PCR擴增及SNP位點鑒定

取144份赤水烏骨雞和98份泰和烏雞血樣DNA，分別構建DNA混池并進行PCR擴增，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，陽性PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。運用DNASTAR中的Seq Man將DNA池測序結果與原序列（GenBank登錄號NC_006088）進行比對分析，找出各種群的SNP位點。PCR反應體系25.0 μL：Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板2.5 μL，上、下游引物各1.8 μL，ddH2O 6.4 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;95 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，進行34個循環;72 ℃延伸10 min。

1. 5 TYR基因生物信息學分析

1. 5. 1 mRNA二級結構及蛋白二、三級結構預測 利用在線軟件RNAfold web server（http：//nibiru.tbi. univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）對TYR基因突變前后編碼區序列進行mRNA二級結構預測，并進行比對分析;同時以NPS@：SOPMA secondary structure prediction（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl？page=npsa_sopma.html）預測分析TYR蛋白二級結構，用SWISS-MODEL Interactive Workspace（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預測TYR蛋白三級結構。

1. 5. 2 等位基因頻率估算 運用MWSnap v3.00.74中的標尺測量各SNP位點等位基因相應的峰值，并估算等位基因頻率（Ai）。Ai=Bi/（B1+B2），式中，Ai表示SNP位點某等位基因頻率，B1和B2分別表示測序峰圖上該等位基因1和2峰的高度。

2 結果與分析

2. 1 PCR擴增結果

PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果（圖1）顯示獲得的目的條帶單一清晰，片段大小與預期結果相符，說明設計的PCR擴增引物特異性較好，擴增產物可用于下一步的測序分析。

2. 2 TYR基因SNP位點鑒定結果

利用DNASTAR對赤水烏骨雞和泰和烏雞的TYR基因測序結果與GenBank上已公布的紅色原雞TYR基因序列（GenBank登錄號NC_006088）進行比對分析。由圖2可知，以各外顯子第1個堿基為+1，在Exon1上：泰和烏雞種群在第921位（C921T，同義突變）、第829位（C829T，屬于同義突變）和第1018位（A1018G，Intron1）發現有3個SNPs位點，而赤水烏骨雞上未發現SNP位點，泰和烏雞的TYR1引物單個測序驗證結果如圖3所示;在Exon2、Exon3和Exon4上：赤水烏骨雞和泰和烏雞在其外顯子區的未發生任何變化;在Exon5上：赤水烏骨雞發現1個SNP位點——A205G（反向測序），但位于非編碼區（protein_id=XP_015135298.1）;在Intron1上，兩個雞品種均發現1個SNP位點，突變情況分別為赤G156A和泰T79A;在Intron2上，赤水烏骨雞發現1個SNP位點（赤T7C）;在Intron4上，赤水烏骨雞發現2個SNPs位點（赤G201A和赤C221T）。

2. 3 等位基因頻率估算結果

由表2可知，赤水烏骨雞Intron2-T7C、Intron4-G201A和Intron4-C221T突變前后的等位基因頻率相等，Intron1-G156A突變后的等位基因頻率小于突變前的等位基因頻率;赤水烏骨雞Exon5-A205G及泰和烏雞Exon1-C829T、Exon1-C921T和Intron1-A1018G突變后的等位基因頻率大于突變前的等位基因頻率。

2. 4 TYR基因mRNA二級結構預測結果

利用在線軟件RNA fold web serve對TYR基因突變前后編碼區序列分別進行mRNA二級結構預測分析，結果發現赤水烏骨雞和紅色原雞一致，而泰和烏雞C829T和C921T的突變均引起TYR基因mRNA二級結構改變，具體表現為其最低自由能減小，而穩定性增加。泰和烏雞TYR基因mRNA二級結構預測結果見圖4。

2. 5 TYR蛋白二、三級結構預測結果

赤水烏骨雞TYR蛋白二級結構與紅色原雞一致，由α-螺旋、無規則卷曲、β-轉角及擴展鏈組成，分別占26.65%、55.31%、3.41%和14.63%，其結構圖譜如圖5所示。利用SWISS-MODEL | Workspace預測TYR蛋白三級結構，發現赤水烏骨雞TYR蛋白三級結構主要由α-螺旋、β-轉角和無規則卷曲構成（圖6），與二級結構預測結果一致。

3 討論

烏骨雞黑色素具有抗氧化、抗衰老、延年益壽和抗紫外線等生物學功能（Lin and Chen，2005;Tu et al.，2009），泰和烏雞也因此開發出許多保健食品和調味品，如烏雞白鳳丸、烏雞白鳳口服液、烏雞膏、烏雞酒及烏雞精復合調味品等（邱禮平和姚玉靜，2005）。目前，關于赤水烏骨雞的保健作用仍停留在烹飪膳食方面，尚未加工生產出相關產品。赤水烏骨雞烏度略淺于泰和烏雞，但其生長速度及飼料轉化率均高于泰和烏雞，且維生素E、必需氨基酸、必需脂肪酸等含量高于大部分雞種（李思，2015）。因此，利用分子遺傳學技術選育烏度更深的赤水烏骨雞，并進一步開發其食用及藥用價值顯得尤為重要。

本研究在兩個烏雞品種中共發現9個SNPs位點，僅泰和烏雞的Exon1-C829T和Exon1-C921T位于編碼區，且均為同義突變，其他SNPs位點均處于非編碼區。其中，泰和烏雞Exon1-C829T與陸曉屏等（2015）對他留烏骨雞研究的SNP4位點、路宏朝等（2014）對略陽烏雞研究的C849T位點屬于同一位點;泰和烏雞Intron1-A1018G與他留烏骨雞SNP6位點（陸曉屏等，2015）是同一位點;赤水烏骨雞Intron2-T7C與略陽烏雞G23549C位點（路宏朝等，2014）是同一位點;赤水烏骨雞Intron4-G201A和Intron4-C221T與他留烏骨雞SNP18和SNP20位點（陸曉屏等，2015）分別屬于同一位點。上述SNP位點均是基于羽色性狀相關研究所獲得，其是否是導致赤水烏骨雞與泰和烏雞烏度差異的原因有待進一步探究。

此外，泰和烏雞Exon1-C921T與SNP5位點（陸曉屏等，2015）和2866C/T位點（張建勤等，2008）是同一位點，且該位點在寧夏固原雞（肉色為淡黑色）、海南文昌雞（肉色為淡黃色）、西藏藏雞（肉色為淡黃色）中的優勢等位基因型分別為CC型、CT型和CC型，在海賽克斯雞種（肉色為白色）只檢測到CT型和TT型，以TT型為優勢等位基因型，且這兩個基因型和等位基因分布在不同雞品種間存在明顯差異。本研究通過對Exon1-C921T位點mRNA二級結構進行預測，發現其最小自由能降低，而穩定性增加;對其等位基因頻率估算發現T為優勢等位基因，由此推測Exon1-C921T是影響赤水烏骨雞和泰和烏雞烏度差異的原因之一。

4 結論

Exon1-C921T突變很可能會對雞的肉色產生影響，故推測Exon1-C921T是影響赤水烏骨雞和泰和烏雞烏度差異的原因之一。

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（責任編輯 蘭宗寶）