食物分離株細菌素RM1的特性及應用研究

張雪穎

摘?要：乳酸菌產生的細菌素由于其作為天然防腐劑和化學防腐劑的天然替代品而受到越來越多的關注。對從食物分離株RM1產生的細菌素（Ent-RM1）的特性及應用進行了研究，結果表明：篩選的細菌素 Ent-RM1具有較高的熱穩定性和較寬的pH穩定性，對蛋白酶K敏感。用16%的三-三甲基十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，Ent-RM1的分子量約為4.0k～4.5kDa。硫酸銨沉淀法提取的 Ent-RM1（44.7 IU/mL Nisin當量）對接種到牛乳中的單核細胞增生李斯特菌 Scott A有殺菌作用，對蠟狀芽孢桿菌ATCC 11778具有抑菌作用。在磷酸鹽緩沖液與高壓處理聯合作用，Ent-RM1對大腸桿菌K12表現出協同滅活作用，表明Ent-RM1對控制食品工業中的細菌污染具有實際應用價值。

關鍵詞：食物分離株細菌素Ent-RM1;熱穩定;耐酸;殺菌;滅菌

腸球菌是溫血動物胃腸道內的正常菌群，由于其GRAS（Generally Recognized as Safe）特性而被廣泛用于食品工業[1-2]。在多種食物中均可分離到腸球菌，包括牛奶[3]、蔬菜[4]，奶酪[5-7]和香腸[8]等發酵食品。由于其蛋白水解、脂解酶活性和檸檬酸鹽利用等特征，腸球菌在其他奶酪的成熟和香氣發展中起重要作用。腸球菌已成功用作奶酪中的起子或輔助培養物，包括用于食品和其他膳食補充劑[9]。 目前細菌素作為食品防腐劑的應用主要集中在乳酸菌，包括乳球菌、乳酸桿菌、小球菌、明串珠菌產生的細菌素。有關腸球菌產生的細菌素在食品中的應用研究較少。腸球菌產生的細菌素通常稱為腸球菌素，可抑制一些食源性病原體，如單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、肉毒梭菌、分枝桿菌、大腸埃希菌和粘球菌[10-13]的生長。考慮到特定的腸毒素可能具有獨特的特性和抗菌潛力，分離新的細菌素將是十分必要的。本研究從不同食品中篩選產生腸毒素的腸球菌，為其在食品保鮮中的潛在應用提供科學依據。

1?材料和方法

1.1?指示菌株和生長條件

植物乳桿菌ATCC 8014作為指示菌進行食物分離株篩選，存儲于20%甘油的Lactobacilli DeMann，Rogosa and Sharpe （MRS）肉湯，-80℃備用。平板劃線法接種指示菌在MRS瓊脂板并于30℃溫育過夜。單個菌落接種到MRS肉湯中，30℃溫育過夜。所得培養物用于接種軟瓊脂覆蓋物（0.75%）以檢測細菌素活性。

1.2?產細菌素的食物分離株的篩選

選擇乳制品、香腸、水果、發酵橄欖、生肉和生牛乳等19種不同的食品，采用軟瓊脂覆蓋法篩選細菌素產生菌[14]。0.1%蛋白胨水與食物以1∶10（w/v）系列稀釋，將系列稀釋液涂布在MRS瓊脂平板上，30℃下培養48h;制備指示菌。10mL的MRS軟瓊脂覆蓋在約有100個菌落的平板，30℃下培養24h，周圍有明顯的抑菌區的菌落被認為是潛在的細菌素產生者。這些菌落在MRS瓊脂上分離，同時檢測革蘭氏反應和細胞形態，存儲于20%甘油中-80℃備用。

1.3?抗微生物活性測定

草坪斑點試驗[14]用于確定細菌素。過夜培養的分離株培養液離心（8 000×g、4℃、10 min），獲得無細胞上清液。10μL上清液涂布于MRS軟瓊脂平板上，30℃培養18h，觀察抑制區的出現。為了排除噬菌體的可能性，從抑制區無菌切出一片瓊脂，0.1%蛋白胨水勻漿與MRS軟瓊脂混合，將其與指示菌隔夜培養混合，倒入培養皿，檢測噬菌斑的存在。

1.4?抗菌譜

所有食物分離株均接種于5 mL MRS肉湯中，30℃培養24h。其他革蘭氏陽性菌和革蘭陰性菌接種到5mL的肉湯中，37℃培養24h。10μL無細胞上清液（調節pH值6.5～7.0），點至過夜培養的軟瓊脂上，30℃培養24h，并記錄抑菌活性。共有14株廣譜抗菌活性的菌株被檢出，其中一株命名為RM1，其產生的細菌素命名為 Ent-RM1，由于其具有最廣譜的抗菌活性而被選出進行下一步研究。

1.5?食物分離株的鑒定

根據16SrRNA基因序列分析鑒定食物分離株的種屬。使用DNA分離試劑盒（（DNeasy Tissue Kit）提取分離株的總DNA。通用寡核苷酸引物fD1（5-CCG AAT TCG TCG ACA ACA GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3）和rD1 （5-CCC GGG ATC CAA GCT TAA GGA GGT GAT CCA GCC-3）擴增16SrRNA基因[15]。Taq DNA聚合酶試劑盒（QIAGEN）用于聚合酶鏈擴增反應（PCR）。PCR反應包括初始變性（在95℃下3min），30個變性循環（95℃ 1min）后、退火（52℃ 30s）和延伸（72℃ 2min），最后延伸（72℃ 10min）。所有的PCR反應均在Techgene DNA熱循環儀中進行。PCR產物經DNA提取試劑盒（QIAGEN）純化，連接到pGEM-T Easy 載體中（Promega Corporation），化學轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞。二氧化硅旋轉柱（QIAGEN）從含氨芐青霉素（100mg/mL）的LB（Luria-Bertani）肉湯中過夜培養獲得重組質粒。用非限制性內切酶Not I（New England Biolabs）消化重組質粒。另外，使用T7終止子和SP6啟動子引物，通過Plant and Microbe Genomics Facility對插入的DNA片段進行測序。使用BLAST工具將獲得的基因序列與NCBI GenBank中的已知細菌序列進行比較。最終的種屬鑒定僅基于具有97%最小相似性的最高得分查詢來實現。

1.6?細菌素活性鑒定

以1∶10將MRS軟瓊脂接種到指示菌隔夜培養物中，倒入培養皿，25°C放置10 min，再從指示培養瓊脂中切出直徑為4 mm的孔。在0.1%蛋白胨水中制備了RM1無細胞上清液的2倍稀釋液，將其置于瓊脂井孔中（50mL）。無菌0.1%蛋白胨水作為對照組。30℃下隔夜培養，測量并記錄井壁周圍的抑制區。以顯示指示劑草坪的清晰抑制區的最高稀釋度的倒數，乘以因子20以獲得AU / mL的任意活性單位測量細菌素滴度[10]。

1.7?酶和熱處理的影響

過夜培養的分離株RM1無細胞上清液（1mL）用以下酶（終濃度1μg/ mL）37℃處理2h：在20mmol/L Tris-HCl中的α-胰凝乳蛋白酶，pH 8.0;胃蛋白酶在0.002N HCl中;脂肪酶在0.1mmol/L磷酸鉀中，pH 6.0;木瓜蛋白酶在0.05mmol/L磷酸鈉中，pH 7.0;胰蛋白酶在40mmol/L Tris-HCl中，pH 8.2;蛋白酶在20mmol/L Tris-HCl中，pH 7.8;蛋白酶K和無花果苷在20mmol/L磷酸鈉，pH 7.0中。未經處理的無細胞上清液作為陽性對照。草坪斑點法測定Ent-RM1經熱處理后的活性，即RM1無細胞上清液（1mL）在100℃靜置5、10、30min后，觀察其活性。

1.8?不同pH值下的穩定性

用1mmol/L HCl或1mmol/L NaOH調節無細胞上清液的pH值，室溫下培養1h，再將上清液調至中性pH值，用草坪斑點試驗測定Een-RM1在不同pH值（pH 3.0、7.0、9.0）下的穩定性。未調節pH值的無細胞上清液為對照。

1.9?Ent-RM1粗提

分離株RM1隔夜培養液5mL轉至1 000 mL新鮮MRS肉湯中，30℃培養24h，4℃離心（12 000×g，15 min）后，硫酸銨加入無細胞上清液中至60%的飽和，4℃溫和攪拌過夜。經4℃離心（12 000×g，30 min）后，懸浮于50 mL磷酸鉀緩沖液（PBS，50mmol/L，pH 6.5）中。在4℃下，用1 kDa截留膜透析管對1 000 mL磷酸鉀緩沖液（100 mm，pH 7.0）進行透析，共4次。命名為CE-RM1剩余的溶液（∽20 mL）通過0.2mm孔徑的低蛋白結合濾器（Millipore Corp.）滅菌，-20℃儲存備用。

1.10?CE-RM1的活性量化

以商品Nisin為標準，測定CE-RM1的相對活性[10]。Nisin溶于蒸餾水（目標濃度為1 000 IU/mL），1mol/L HCl調節到pH 2.0，在121 oC滅菌15 min。將濃度分別為100、50、12.5、6.25、3.13 IU/mL的Nisin （5mL）接種于63孔MSR軟瓊脂上。同時點樣5μL CE-RM1，30℃下培養24h，觀察抑制區并測量其直徑，構建劑量反應圖，用以確定CE-RM1的Nisin等效單位。

1.11?分子量評估

采用16%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），對 Ent-RM1的分子量進行了初步分析評估。使用預染色的低范圍分子量蛋白質標記物作為大小參考[16]。10μL CE-RM1加載到凝膠上，電泳后分離這兩組泳道。通過用考馬斯藍固定和染色，一半凝膠用于分子量測定。另一半通過在20%（v / v）異丙醇和10%（v / v）乙酸中連續固定（30min/次），蒸餾水中洗滌，并室溫保持過夜，測定抗微生物活性，即用MRS軟瓊脂覆蓋洗過的凝膠，30℃下培養18h，觀察蛋白質條帶周圍抑制區。

1.12?CE-RM1在牛乳中的抗菌性能

在市售滅菌牛乳中接種單核細胞增生李斯科特ScottA和蠟樣芽孢桿菌ATCC 121778檢測以CE-RM1的抗菌性。在已經接種了致病菌（103 CFU/mL）的9mL牛乳中加入1mL CE-RM1，35oC培養24 h，同時以沒有加CE-RM1的接種液作為對照。在選定的時間點，將接種的牛乳在0.1%蛋白胨水中連續稀釋并涂布在TSA平板中，以確定CE-RM1對牛乳中病原體生長的影響。35℃溫育24～48h以計數存活者（CFU/mL）。

1.13?超高壓處理（HPP）和CE-RM1聯合作用對大腸桿菌K12的滅活

離心（12 000×g、4℃、10min）后收集靜止期（109CFU / mL）的大腸桿菌K12細胞（25mL），25mL無菌磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，12.5mol/L，pH 7.2）洗滌2次，懸浮于25mL PBS中。將細胞懸液（900μL）與PBS（100μL）或CE-RM1（100μL）混合，無菌轉移至無菌聚乙烯袋，熱密封。在含有1∶1（v / v）乙二醇的高壓處理器（Quintus QFP-6，Flow Pressure Systems）中將樣品袋在500MPa和25±2℃下加壓1min水壓傳輸液（Houghto-Safe 620 TY）。此外，含有PBS（100μL）或CE-RM1（100μL）的樣品用作對照，冰上備用。將所有樣品在0.1%蛋白胨水中連續稀釋并涂布在TSA上，37℃培養24～48h以計數存活者（CFU/mL）。該實驗獨立重復3次。

2?結果與分析

2.1?具有抗菌活性的分離物的分離和鑒定

共有51株菌被分離，這些從食品中分離的菌株均為非孢子革蘭氏陽性球菌。其中14株分離菌株分別命名為 3E1、 3E2、 3E3、 3E4、 3E5、 3E6、5B1、6F2、6F3、15I2、16D1、16D2、B1和RM1，對食源性病原菌單核細胞增生李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌具有抗菌活性（表1）。此外，使用草坪斑點試驗法檢測抗微生物特性，表征顯示抑菌圈為細菌素的作用而非噬菌體所致。基于16S rRNA基因序列分析，這14株分離菌株均被鑒定為腸球菌屬（Enterococcus spp.）。14株分離株產生的細菌素能夠抑制單核細胞增生李斯特菌生長的能力。其中，具有最廣譜的抗菌活性的分離株RM1被鑒定為糞腸球菌（Enterococcus faecalis），有研究報道，非食物系統中糞腸球菌的高流行率是各種食物中天然微生物群的普遍成員[1，17-18]。

2.2?Ent-RM1的特性

Ent-RM1對指示菌顯示出強的抗菌滴度（1 280AU/ mL），其活性對熱和各種酶處理的敏感性見表2。100℃處理10min后，Ent-RM1的抗微生物活性仍然保留，表明其相對熱穩定性。但活性在100℃熱處理20min完全消失。此外，Ent-RM1在很寬的pH內都很穩定。與Nisin不同，其溶解度和活性隨pH值的增加而降低，直至活性完全消失[19]，Ent-RM1在室溫下培養1h后在3.0～9.0的pH范圍內仍保持其活性。Ent-RM1對蛋白酶K和α-胰凝乳蛋白酶敏感，表明其蛋白質特性，部分活性在胰蛋白酶處理下丟失，揭示其抑制作用的亞態的蛋白質性質。對脂肪酶的抗性表明Ent-RM1不需要脂質部分用于活性。綜上所述，Ent-RM1可能是巴氏殺菌、酸性或堿性食品或食品中潛在的添加劑。由草坪斑點法及細胞上清液中產生的抗菌活性顯示，Ent-RM1既可在固體培養基中產生，也可以在液體培養基中產生，原因是一方面細菌素在產生細菌素的菌株表面所必需的吸附作用;另一方面，產生菌與指示菌之間必須進行物理接觸，才能誘導細菌素的產生。這些控制系統可以節省細菌細胞的能量。

2.3?Ent-RM1相對活性值

為了量化CE-RM1的活性，使用商業Nisin作為參考標準測定相對細菌活性值。由圖1可知，測量CE-?RM1的抑制區直徑為16 mm，與標準劑量反應圖中的類似點相匹配，確定CE-RM1的當量濃度為44.7 IU /mL。

2.4?Ent-RM1分子量評估

通過16%Tris-tricine SDS-PAGE分析，結果表明，Ent-RM1的分子量約為4.0k～4.5kDa（圖2泳道C）。因為通過SDS-PAGE測定值是近似的，故該分子量是估計值。

2.5?食源性病原體的滅活

圖3結果表明，處理1h后，單核細胞增生李斯特菌Scott A的群體降低至檢測限（101CFU / mL）以下，顯示Ent-RM1具有針對該病原體的殺菌作用（圖3A）。CE-RM1抑制芽孢桿菌ATCC 11778生長的結果見圖3B，在整個培養期間該病原體的沒有明顯生長，表明Ent-RM1具有針對蠟狀芽孢桿菌的抑菌作用。

2.6?HPP與CE-RM1的協同效應

為了滅活革蘭氏陰性細菌，用HPP和CE-RM1協同對大腸桿菌K12進行處理（圖4）。用HPP單獨處理或者CE-RM1單獨處理大腸桿菌K12沒有顯著差異，表明單獨的Ent-RM1對該革蘭氏陰性細菌沒有抗菌活性，可能是由于外膜的屏障特性[20]。雖然革蘭氏陰性菌的膜轉運蛋白孔蛋白允許600 Da以下的親水分子自由擴散，但 Ent-RM1太大（4.0k～4.5 kDa），無法橫穿外膜[12]，因此，Ent-RM1不能到達細胞質膜，大多數細菌素所攻擊的靶標[7]。CE-RM1與HPP組合導致大腸桿菌K12明顯失活，與對照（未經任何處理）相比平均群體減少5.5log，而僅由HPP引起3.0log減少，表明HPP和Ent-RM1有協同抗微生物的作用。由于革蘭氏陰性菌的外膜被認為是由于HPP后外膜蛋白的變性而受損，因此，Ent-RM1可進入細胞質膜，導致細胞的致死性[11]。

3?結論

本研究中，51株可產生細菌素的細菌從不同的食物中分離出來。采用草坪班點法，對14株對食源性病原菌（單核細胞增生李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌）具有抗性的食物分離株進行了鑒定。結果顯示，這14株分離株均被鑒定為腸球菌屬，其中從牛乳中分離出一株具有廣譜抗菌活性并且具有很強的抗菌活性的菌株進行研究。通過16S rDNA測序將此新分離的食源性菌株鑒定為腸球菌（Enterococcus faecalis），并命名為菌株RM1，其產生的細菌素被命名為Ent-RM1。雖然腸球菌在奶酪中的使用備受爭議，如南歐一些國家用腸球菌作為起子發酵奶利用的是腸球菌對奶酪風味的影響，而北歐一些國家卻持反對意見，但一些研究表明，食物分離株腸球菌對于傳統奶酪的成熟和香味的形成具有積極的作用[21]。同時，腸球菌能夠抑制食源性病原菌，如李斯特菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、產氣莢膜菌等的生長。細菌素的功效常受到食物生態系統中食物組成等條件的影響[22]。本研究對Ent-RM1在接種到牛乳中的食源性病原菌進行的抗性實驗結果表明，腸球菌RM1對牛乳中的單核細胞增生李斯特菌具有快速殺菌活性，對蠟狀芽孢桿菌具有抑菌作用;同時，Ent-RM1在高達100℃和較寬pH范圍內具有穩定性，使其可以作為天然防腐劑或食品添加劑用于食品中控制細菌污染，以提高產品的保質期。

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（責任編輯?唐建敏）