松木材中揮發性成分對臺灣乳白蟻行為的影響

宋燦燦 周祥 徐凡丁 宋游

摘要：【目的】探究松木材揮發性物質對臺灣乳白蟻嗅覺行為的影響，為研發高效誘集劑提供參考依據。【方法】運用索氏提取和固相微萃取兩種樣品前處理方法提取松木材中的揮發性成分，采用氣相色譜—質譜聯用（GC-MS）分析揮發性物質的化學組成;從鑒定出的物質中選擇8種化合物，使用四臂嗅覺儀進行臺灣乳白蟻嗅覺行為試驗。【結果】采用索氏提取和固相微萃取前處理方法分別從松木材中鑒定出45和27種組分。從兩種方法鑒定出的化合物中選取8種化合物（α-松油醇、馬鞭草烯醇、乙酸龍腦酯、雪松醇、α-蒎烯、桃金娘烯醛、乙酸松油酯和長葉烯）進行臺灣乳白蟻嗅覺行為試驗，雙向競爭試驗結果，在1.00 mg/mL質量濃度下長葉烯、雪松醇、馬鞭草烯醇和桃金娘烯醛對臺灣乳白蟻均具有引誘作用;乙酸龍腦酯和α-松油醇對臺灣乳白蟻具有趨避作用;α-蒎烯和乙酸松油酯對臺灣乳白蟻的趨性不明顯;四向競爭試驗結果，不同質量濃度的化合物對臺灣乳白蟻的引誘程度不同。【結論】松木材中存在的揮發性成分長葉烯、雪松醇、馬鞭草烯醇和桃金娘烯醛對臺灣乳白蟻均具有引誘作用，具有開發應用于白蟻餌劑的潛力。

關鍵詞： 臺灣乳白蟻;松木材;揮發性物質;固相微萃取;四臂嗅覺儀

中圖分類號： S475.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）01-0074-07

0 引言

【研究意義】全世界約有白蟻3000種，分布在南、北緯45°之間的熱帶、亞熱帶地區。白蟻作為世界性的五大害蟲之一，對國民經濟的影響涉及房屋建筑、園林綠化、堤壩水庫、農林植物等多個方面（黃復生等，2000;陳海江等，2016）。據不完全統計，全球每年因白蟻為害造成的經濟損失達400億美元（Rust and Su，2012），其中對房屋建筑危害最嚴重的是乳白蟻屬（Coptotermes）中的臺灣乳白蟻（Coptotermes formosanus）（王明生等，2015）。近年來，隨著對環境關注度的提高，一些對白蟻有效的防控藥劑如滅蟻靈等被逐步禁用，因此開發新型藥劑和新的防控技術成為白蟻研究的一個重點。【前人研究進展】一直以來，科研工作者對寄主植物散發的氣味調控昆蟲化學通訊行為開展了系列研究，通過利用一些揮發物的功能特性進行害蟲防治，如引誘劑的研發等（白鵬華等，2018）。目前已有大量植物揮發物對昆蟲引誘作用的報道，如篩豆龜蝽對大豆不同生育期的偏好性選擇受大豆揮發物的影響（Yang et al.，2017）;玉米在果穗期釋放的揮發物對亞洲玉米螟未交配成蟲的定向行為具有引誘作用（蔣興川等，2018）;水稻中的部分揮發物對稻虱纓小蜂具有顯著引誘效果（李婷等，2018）。作為一種社會性昆蟲，白蟻個體間主要依賴各種信息交流機制進行聯系與協商，常用聯系信號為具有揮發性的化學物質（童志勛，2015）。劉炳榮等（2010）研究發現，臺灣乳白蟻對不同溶劑提取的馬尾松提取液表現出不同取食喜好性選擇，說明木材中不同的次生化合物種類及含量對臺灣乳白蟻取食有一定影響。利用植物材料和其他具有引誘作用的添加物可增強白蟻對餌劑的喜食性和選擇性。候亞會等（2018）研究表明，對苯二酚10 ng/cm2劑量條件下與茶多酚質量比為1∶5的混合處理可顯著提高對臺灣乳白蟻的誘食效果。【本研究切入點】不同種類白蟻對食物具有較強的選擇性，尤其在食物較充足的情況下，為了提高誘集效果，篩選出具有較好引誘效果的誘集劑顯得尤為重要。目前，有關白蟻喜食木材中含有次生揮發性成分對白蟻行為影響的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】選取市售裝修建材常用的松木木材為材料，運用固相微萃取和索氏提取兩種樣品前處理方法提取木材中的揮發性成分，采用氣相色譜質—譜聯用（GC-MS）分析揮發性物質的化學組成;選取分析鑒定出的揮發性成分，使用四臂嗅覺儀進行臺灣乳白蟻嗅覺行為試驗，以期篩選出對臺灣乳白蟻行為具有影響作用的揮發性化學物質，進而為研發引誘效果較好的誘集劑提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

臺灣乳白蟻誘集自海南大學校園內，置于海南大學熱帶農林學院基地養蟲室飼養供試驗用。試驗用木材松木購自海南省海口市美蘭區三和木材加工廠。試驗用試劑名稱、純度、來源詳見表1。

1. 2 木材揮發性成分的提取與鑒定

1. 2. 1 材料準備 在實驗室內將木材加工成2 cm×2 cm×1 cm的小木塊，使用粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）粉碎，過20目篩，置于冰箱密封待用。

1. 2. 2 索氏提取法前處理 將裝有木材粉末的濾紙筒放入提取管中，倒入丙酮溶劑（為避免試驗中過高的溫度導致提取到的揮發性成分大量損失，選取丙酮作為提取溶劑，并將提取溫度控制在60 ℃以下），接上回流冷凝器，用乳膠管將冷凝管與自來水管相連，水流方向為下進上出，在電熱套（常州潤華電器有限公司）中抽提，通過調節溫度，控制虹吸速率為5～10次/h。回流加熱12 h，經旋轉蒸發后用正己烷定容，得到該木材粉末的提取液，置于4 ℃冰箱保存待測（韋芳三等，2011）。

1. 2. 3 固相微萃取法前處理 將待提取的木材粉末放入清洗干凈的大培養皿中（不加蓋），并用兩端開口無色無味的烤箱袋（泰斯科瑪品牌）進行套袋處理，連接氣路如圖1所示[大氣采樣儀：QC-1S型氣體采樣儀（北京市勞動保護科學研究所）;流量計：LZB-3WB玻璃轉子流量計（常州雙環熱工儀表有限公司）]。用已活化好的萃取頭（美國Supelco公司，65 μm PDMS/DVB）頂空吸附30 min后取下萃取頭，放入氣相色譜質譜聯用儀進樣口，解吸附3 min。

1. 2. 4 氣相色譜質譜聯用分析 使用安捷倫7890B-7000B氣相色譜—質譜聯用儀對上述兩種前處理得到的樣品進行GC-MS分析，樣品中的揮發性成分經氣相色譜分離，再用質譜進行分析鑒定。分析結果經初步處理后利用計算機譜庫（化合物匹配度不低于80%）進行檢索及分析，結合有關文獻，確認揮發性物質的化學組成，通過各揮發性化合物的峰面積進行定量分析（相對含量）（徐永霞等，2013）。

1. 3 臺灣乳白蟻對揮發性成分的行為選擇

1. 3. 1 嗅覺行為試驗設計 對篩選出的8種化合物的標準品試劑，經預試驗，用液體石蠟將標準品試劑稀釋至適宜倍數待測（黃安平，2012）。為模擬白蟻外出取食的環境，每組試驗選擇健壯的臺灣乳白蟻工蟻90頭加兵蟻10頭，共計100頭，重復4次。試驗用四臂嗅覺儀購自無錫久平儀器有限公司，其連接如圖2所示。由于臺灣乳白蟻畏光，因此整個試驗過程需進行遮光處理（圖中虛線部分為遮光處理部分）;收集瓶具有陷阱裝置功能，故試驗中不需要觀察，待試驗結束后統計收集瓶中的白蟻數量。

1. 3. 2 雙向競爭試驗 為篩選出對臺灣乳白蟻具有引誘活性的標準品試劑，關閉四臂嗅覺儀的兩個氣體通路，在直線方向上檢測臺灣乳白蟻的趨向性行為。將待測標準品試劑用液體石蠟稀釋至1.00 mg/mL作為試驗劑量，以液體石蠟作為對照組。待通入氣流穩定后放入待測臺灣乳白蟻100頭，試驗持續時間30 min，記錄進入誘集瓶中的臺灣乳白蟻數量（張輝潔等，2012）。

1. 3. 3 四向競爭試驗 將上述雙向競爭試驗中篩選出的對臺灣乳白蟻具有引誘活性的標準品試劑，用液體石蠟稀釋成0.01、0.10、1.00和10.00 mg/mL，測試在不同質量濃度條件下臺灣乳白蟻對某一種化合物的不同趨性，試驗操作方法同1.3.2。

1. 4 統計分析

統計收集瓶中的臺灣乳白蟻數量，運用以下公式計算相關參數：

反應率（%）=（味源管中蟲數+對照管中蟲數）/

測試總蟲數×100

選擇反應率（%）=味源管中蟲數/（味源管中蟲

數+對照管中蟲數）×100

選擇系數=（味源管中蟲數-對照管中蟲數/

（味源管中蟲數+對照管中蟲數）

其中，選擇系數大于0，表示試蟲對味源物質有趨性，數值越大、趨性越強，最大值為1;選擇系數小于0，則表示試蟲對味源物質有負趨性（忌避性） （梁小松等，2007）。試驗數據使用SPSS 22.0進行統計分析（鄒祎，2016）。

2 結果與分析

2. 1 木材中的揮發性成分

2. 1. 1 索氏提取法提取結果 采用索氏提取法處理試驗用松木材粉末，對處理獲得的樣品進行GC-MS分析，得到的色譜圖出峰保留時間集中在8～40 min。通過譜庫檢索及查閱文獻，鑒定出45種組分（表2），其中醇類17種、酯類7種、烯萜類6種、烷烴類4種、醛酮類7種、酸類和酚類各2種。

2. 1. 2 固相微萃取法提取結果 采用固相微萃取法處理松木材粉末，對處理獲得的樣品進行GC-MS分析，得到的色譜圖出峰保留時間集中在2～16 min。通過譜庫檢索及查閱文獻，分析鑒定得到27種組分（表3），其中醇類5種、烯萜類5種、苯類4種、醛酮類9種、酯類2種、烷烴類和醚類各1種。

2. 1. 3 2種樣品前處理方法結果比較 由表2和表3可知，2種樣品前處理方法得到的結果略有差異。索氏提取法鑒定出45個組分，固相微萃取法鑒定出27個組分，其中，鑒定出10個共同組分，分別為苯甲醛、3-蒈烯、葑醇、（S）-2，2，3-三甲基環戊-3-烯-1-乙醛、2-莰醇、α-松油醇、馬鞭草烯醇、順式香芹醇、香芹酮和乙酸龍腦酯。雖然采用索氏提取法費用較低，但由于索氏提取需要使用有機溶劑，一方面無法保證樣品提取徹底，另一方面繁瑣的操作步驟增加了試驗結果的誤差;而固相微萃取技術是一種新型的無溶劑樣品處理方法，集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，簡單方便（Kataoka et al.，2000），精確性更高，可快速分析木材中的揮發性成分。因此，后續對臺灣乳白蟻雙向競爭試驗的揮發物種類選擇，選取2種樣品前處理方法中相對含量較高的3個共同組分（α-松油醇、馬鞭草烯醇和乙酸龍腦酯）和5個含量較高的組分[索氏提取法1個（雪松醇）、固相微萃取法4個（α-蒎烯、桃金娘烯醛、乙酸松油酯和長葉烯）]。

2. 2 臺灣乳白蟻對揮發性成分的行為選擇

2. 2. 1 雙向競爭試驗結果 由表4可知，臺灣乳白蟻對不同化合物標準品試劑的反應不同。根據選擇系數可知，桃金娘烯醛、馬鞭草烯醇、長葉烯和雪松醇4種化合物對臺灣乳白蟻具有引誘作用;乙酸龍腦酯和α-松油醇2種化合物對臺灣乳白蟻具有趨避作用;α-蒎烯和乙酸松油酯2種化合物對臺灣乳白蟻的趨性不明顯。

2. 2. 2 四向競爭試驗結果 由表5可知，不同質量濃度的化合物標準品對臺灣乳白蟻的引誘程度不同。長葉烯的反應率為84.00%時，在0.10 mg/mL質量濃度下的效果最好，對臺灣乳白蟻的選擇反應率為37.03%，且顯著高于1.00和0.01 mg/mL質量濃度處理（P<0.05，下同）;雪松醇的反應率為89.00%時，隨著質量濃度的升高對臺灣乳白蟻的引誘效果越好，其中在10.00 mg/mL質量濃度下的效果最好，對臺灣乳白蟻的選擇反應率為38.57%，顯著高于其他3個質量濃度處理;馬鞭草烯醇的反應率為76.00%時，在1.00 mg/mL質量濃度下的效果最好，對臺灣乳白蟻的選擇反應率為45.96%，顯著高于10.00和0.01 mg/mL質量濃度處理;桃金娘烯醛的反應率為94.25%時，0.10、1.00和10.00 mg/mL 3個質量濃度處理的效果相當，對臺灣乳白蟻的選擇反應率差異不顯著（P>0.05），且均顯著高于0.01 mg/mL質量濃度處理。

3 討論

作為一種常用的提取方法，索氏提取已廣泛應用于植物材料中各種化合物的提取和含量測定，其具有連續回流提取、節省提取溶劑、提取效率較高等優點，但也存在提取時間較長、提取不徹底等問題（彭志遠，2017）。固相微萃取是在固相萃取技術基礎上發展起來的新型綠色前處理技術，操作簡單，用時少，整個過程不需要使用溶劑，集采樣、濃縮于一體，并且可與多種儀器聯用，能夠快速準確地分析出植物材料中的揮發性成分（Lord and Pawliszyn，2000;王科等，2017）。劉軍鴿等（2013）利用固相微萃取和GC-MS聯用測定干辣椒油樹脂中的香氣成分，吳丹楓等（2018）采用索氏提取和液體進樣GC-MS聯用測定干辣椒油樹脂中的香氣組分，兩者提取方法結果相比較，檢測出的物質組分存在差異，與本研究采用索氏提取和固相微萃取前處理法提取檢測松木材中的揮發性物質成分的結果一致。

本研究選取8種化合物對臺灣乳白蟻進行嗅覺行為試驗。在化合物的選擇上，一是選擇兩種方法中相對含量較高的3個共同組分（α-松油醇、馬鞭草烯醇和乙酸龍腦酯）;二是兩種方法鑒定出的10 種共同組分屬于4種物質類別，分別為烯萜類、醇類、醛酮類和酯類，因此以4種物質類別為依據選取8種化合物，分別為烯萜類2種（α-派烯和長葉烯）、醇類2種（α-松油醇和雪松醇）、醛酮類2種（桃金娘烯醛和馬鞭草烯醇）和酯類2種（乙酸龍腦酯和乙酸松油酯），由于在固相微萃取中未檢測鑒定出烷烴類，因此未選擇烷烴類組分;三是有些組分雖然已經鑒定出而且含量較高，但實踐中獲取相對困難或代價相對較高，故未選取用于行為試驗。本研究結果僅針對所選擇的8種化合物，不能排除其他組分可能會更合適用于臺灣乳白蟻嗅覺行為試驗，因此，有必要對松木材中揮發性成分對臺灣乳白蟻的行為影響進行更深入研究。

Reinhard等（2002）對14種白蟻的下唇腺分泌物進行化學分析及進一步室內外生測試驗結果表明，對苯二酚對所有供試白蟻種類均有顯著的誘食效果。Raina等（2005）在利用對苯二酚作為引誘劑防治白蟻過程中發現較高濃度的對苯二酚對臺灣乳白蟻具有趨避作用。不同的白蟻信息素對各種白蟻起作用的反應閾值、最低濃度、耐受的最高濃度不同（程冬保，2013）。因此，本研究在對8種化合物進行引誘效果篩選時先進行預試驗，選定一個比較適宜的質量濃度（1.00 mg/mL）作為試驗劑量;后續對4種有引誘作用的化合物進行了不同質量濃度梯度試驗，以期篩選出最佳作用濃度。

臺灣乳白蟻為土木兩棲性白蟻，畏光喜靜，鑒于此，本研究用經改裝的大紙箱對四臂嗅覺儀進行遮光處理，并盡量保持試驗環境安靜。此外，由于揮發性物質具有復雜性、多樣性和時空易變性等特性，而臺灣乳白蟻所處的環境是一個復雜的動態系統（張紅兵等，2005），因此，本研究所取得的相關結果還需進行室外的田間試驗加以驗證。

4 結論

松木材中存在的揮發性成分長葉烯、雪松醇、馬鞭草烯醇和桃金娘烯醛對臺灣乳白蟻均具有引誘作用，具有開發應用于白蟻餌劑的潛力。

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（責任編輯 麻小燕）