肝片吸蟲CatB4蛋白分子特征及其免疫原性分析

王熙鳳 孟慶玲 喬軍 張凱 張國武

摘要：【目的】明確肝片吸蟲組織蛋白酶B4（CatB4）的分子特征及其免疫原性，為研究肝片吸蟲CatB4蛋白的生物學特性及揭示其致病機理提供科學依據?！痉椒ā客ㄟ^RT-PCR擴增肝片吸蟲CatB4基因，利用在線分子生物信息學軟件對CatB4基因及其編碼蛋白進行分子特征分析;構建原核表達載體pET-CatB4，經IPTG誘導獲得融合蛋白后進行SDS-PAGE和Western blotting檢測分析;并以融合蛋白CatB4免疫小鼠制備多克隆抗體，利用免疫組化對融合蛋白在肝片吸蟲體內的表達進行定位分析?！窘Y果】肝片吸蟲CatB4基因片段為699 bp，其編碼蛋白等電點（pI）7.95，理論分子質量25.89 kD，無信號肽和跨膜區，屬于非分泌性蛋白;CatB4蛋白存在10個潛在的磷酸化位點、2個N-糖基化位點和 7個N-肉豆蔻?；稽c，有9個抗原決定簇，具有高度保守的CatB結構域，是由無規則卷曲連接9個α-螺旋和8個β-折疊構成其空間結構。基于CatB4基因核苷酸序列同源性構建的系統發育進化樹顯示，肝片吸蟲和大片吸蟲聚為一支，二者的同源性為83.98%。SDS-PAGE檢測和Western blotting分析結果均顯示在41.80 kD處能檢測到目的條帶。以純化融合蛋白CatB4與弗氏佐劑乳化后免疫的小鼠均可產生特異性抗體，證實融合蛋白CatB4具有較強的免疫原性;免疫組化定位分析結果顯示，在肝片吸蟲的卵黃腺腺體細胞、排泄管上皮細胞、腸道上皮細胞和卵黃腺管上皮細胞均發生特異性的抗原抗體反應，呈深棕色?！窘Y論】誘導表達獲得的融合蛋白CatB4可特異性識別綿羊肝片吸蟲陽性血清，具有較強的免疫原性，且主要在肝片吸蟲分泌排泄組織器官中表達，說明CatB4蛋白具有作為肝片吸蟲候選抗原的潛力。

關鍵詞： 肝片吸蟲;組織蛋白酶B4（CatB4）;原核表達;免疫原性

中圖分類號： S852.735? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）01-0158-07

0 引言

【研究意義】片形吸蟲病是一種在全球范圍內廣泛分布的人獸共患寄生蟲病（Mas-Coma et al.，2009），主要由肝片吸蟲（Fasciola hepatica）、大片吸蟲（F. gigantica）及其中間型引起，不僅給畜牧業生產帶來巨大經濟損失，還威脅人類健康（何山紅等，2010;Ashrafi et al.，2015）。其中，肝片吸蟲主要分布在溫帶地區，需要中間宿主淡水螺才能完成其生活史，家畜常因在放牧過程中吞食含囊蚴的牧草而被感染（王熙鳳等，2018）。肝片吸蟲病在我國四川、新疆、青海、黑龍江和云南等地區廣泛流行，草食動物（牛、羊）的感染率可高達80%，是對我國畜牧業危害最嚴重的寄生蟲病（黎萬奎等，2003）。因此，加強肝片吸蟲致病機理研究及其疫苗開發，對有效防控肝片吸蟲病和促進畜牧業健康發展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】肝片吸蟲在宿主體內移行過程中會產生大量排泄分泌產物（Excretory-srcretory pro-duct，ESP），ESP主要由肝片吸蟲的盲腸分泌，經口或體表排出。按照其功能，ESP主要分為能量代謝相關蛋白、應激相關蛋白和蛋白水解酶（田艾靈等，2017）。組織蛋白酶（Cathepsin，Cat）是蛋白水解酶中的一種，屬于半胱氨酸蛋白酶家族，占ESP總量的80%，包含組織蛋白酶L（CatL）和組織蛋白酶B（CatB）兩個亞型（Robinson et al.，2008），且二者在肝片吸蟲感染過程中起協同作用。其中，CatL在肝片吸蟲各發育階段均可分泌，而CatB主要在童蟲階段表達分泌。肝片吸蟲囊蚴脫囊后高度表達的CatB有3種（CatB1、CatB2和CatB3），但也有部分蛋白可在成蟲階段大量表達，如CatB4、CatB6、CatB7、CatB8、CatB9和CatB10（Cancela et al.，2008;Cwiklinski et al.，2015）。CatB主要存在于肝片吸蟲的體表，可與宿主免疫系統直接接觸而破壞其免疫功能，實現免疫逃避，同時參與囊蚴的脫囊過程（Beckham et al.，2009）。因此，CatB在肝片吸蟲的成熟、入侵、移行和寄生過程中發揮著至關重要的作用。Robinson等（2009）對肝片吸蟲的蛋白組學進行研究，結果在新脫囊幼蟲期檢測到CatB4;Cwiklinski等（2015）對肝片吸蟲基因組和轉錄組進行分析，發現CatB家族只有1個亞型，但可表達7種不同的蛋白，其中CatB4蛋白在肝片吸蟲各生長階段均可表達，以成蟲階段的特異表達量最高。【本研究切入點】CatB4具有半胱氨酸肽酶活性位點，起到調節催化活性的作用，主要在肝片吸蟲成蟲期分泌表達（Meemon and Sobhon，2015），但目前未對CatB4進行任何分子及生物學方面的研究，其致病機理也尚未明確。【擬解決的關鍵問題】對肝片吸蟲CatB4基因進行克隆及原核表達，制備抗肝片吸蟲CatB4多克隆抗體，并利用免疫組化對CatB4蛋白在肝片吸蟲體內的表達進行定位分析，為研究肝片吸蟲CatB4蛋白的生物學特性及揭示其致病機理提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

肝片吸蟲陽性血清由中國農業科學院蘭州獸醫研究所惠贈提供，肝片吸蟲成蟲采自新疆烏魯木齊市活畜屠宰場綿羊的肝臟;4～6周昆明系小鼠購自石河子大學實驗動物中心;pET-32a（+）質粒、大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感受態細胞由石河子大學寄生蟲實驗室保存提供;限制性核酸內切酶（BamH I和Xho I）、pMD19-T載體、T4 DNA連接酶、IPTG和反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司;PCR Mixture購自廣州東盛生物科技有限公司;DNA Marker、蛋白分子量標準和辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG購自北京全式金生物技術有限公司;HRP標記的兔抗綿羊IgG和NC膜購自北京康為世紀生物科技有限公司;枸櫞酸緩沖液和蘇木素購自上海索萊寶生物科技有限公司;綿羊肝片吸蟲IgG抗體ELISA檢測試劑盒購自上海北諾生物科技有限公司。

1. 2 肝片吸蟲CatB4基因RT-PCR擴增

根據GenBank中的肝片吸蟲CatB4基因序列（登錄號KM099340.1，cDNA長1020 bp，編碼339個氨基酸），利用ABCpred和DNASTAR等在線軟件分析CatB4基因的優勢抗原表位，選擇編碼親水性較強、優勢抗原表位集中的區域（255～954 bp）設計一對特異性引物用于擴增CatB4基因，引物由華大基因生物科技有限公司合成，預期擴增長度699 bp。上游引物：5'-CGGGATCCATGCCGGAGTCTTTTGAT-3'（下劃線部分為BamH I酶切位點），下游引物：5'-CCCT

CGAGTCAAAAGTATCCATTCTCACC-3'（下劃線部分為Xho I酶切位點）。參照TRIzol法提取肝片吸蟲總RNA（李曉娟，2009），采用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，利用上、下游引物擴增CatB4基因。PCR反應體系20.0 μL：cDNA模板2.0 μL，PCR Mixture 9.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性4 min;94 ℃ 40 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環;72 ℃延伸l0 min，4 ℃保存。PCR擴增產物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，切膠回收目的片段連接至pMD19-T載體，經菌液PCR和雙酶切鑒定篩選出陽性質粒，并送至新疆昆泰銳生物技術有限公司測序，將測序正確的質粒命名為pMD-CatB4。

1. 3 肝片吸蟲CatB4基因及其編碼蛋白分子特征分析

采用DNAMAN和DNASTAR對CatB4基因測序結果進行分析;利用ProtPram預測CatB4蛋白的理化性質、ProtScal分析蛋白的親/疏水性、SignalP分析有無信號肽、TMHMM-2.0預測蛋白的跨膜區、Motif Scan預測蛋白潛在的糖基化位點、Antigen Prediction Tool預測其抗原決定簇、CDS分析其結構域、SOPMA和Swiss-model預測蛋白的二、三級結構;并以MEGA 5.0對肝片吸蟲CatB4基因進行系統發育進化分析。

1. 4 原核表達載體pET-CatB4構建

將pMD-CatB4質粒和pET-32a（+）載體分別用BamH I/Xho I進行雙酶切，酶切產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收目的片段并與T4 DNA連接酶4 ℃過夜連接，然后轉化DH5α感受態細胞，挑取單菌落，經菌液PCR和BamH I/Xho I雙酶切鑒定，將測序正確的重組質粒命名為pET-CatB4。

1. 5 融合蛋白CatB4誘導表達、純化及鑒定

以重組質粒pET-CatB4轉化BL21（DE3）感受態細胞中，挑取單菌落，通過菌液PCR篩選出陽性菌接種至含氨芐青霉素（Amp+）的LB液體培養基中，過夜培養至OD600 nm達0.6～0.8時，以IPTG（終濃度1.0 mmol/L）誘導2、4、6和8 h后，分別收集1.0 mL菌液，12000 r/min離心2 min，收集上清液和菌體;并以pET-32a（+）空載體IPTG誘導6 h為對照。SDS-PAGE檢測融合蛋白CatB4的表達形式，并采用鎳離子親和層析柱進行純化。純化融合蛋白CatB4在不同梯度尿素（8、6、4、2和1 mol/L）中分別透析7 h，用蔗糖濃縮至終濃度1.0 mg/mL。同時將純化融合蛋白CatB4印跡到NC膜上，以綿羊肝片吸蟲陽性血清（1∶1000稀釋）為一抗、HRP標記的兔抗綿羊IgG（1∶3000稀釋）為二抗，進行Western blotting分析。

1. 6 融合蛋白CatB4在肝片吸蟲體內表達定位分析

純化的融合蛋白CatB4與弗氏佐劑乳化后免疫小鼠，制備抗肝片吸蟲CatB4多克隆抗體，用綿羊肝片吸蟲IgG抗體ELISA檢測試劑盒檢測免疫小鼠后產生的特異性抗體。制備好的肝片吸蟲成蟲石蠟組織切片在枸櫞酸緩沖液中煮沸修復10 min，冷卻后置于3.0%的H2O2-PBS中孵育10 min，以小鼠抗肝片吸蟲多克隆抗體（1∶150稀釋）為一抗、HRP標記的羊抗鼠IgG（1∶1000稀釋）為二抗，進行免疫組化定位分析，經蘇木素染色后在顯微鏡下觀察結果。陰性對照組以未免疫的陰性小鼠血清為一抗。

2 結果與分析

2. 1 肝片吸蟲CatB4基因克隆結果

采用RT-PCR擴增肝片吸蟲CatB4基因，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得一條約700 bp的目的條帶（圖1），與預期結果相符。切膠回收目的基因片段，克隆至pMD19-T載體上，經雙酶切鑒定分別得到一條2692 bp的載體片段和一條699 bp的CatB4基因片段（圖2），表明肝片吸蟲CatB4基因已成功插入pMD19-T載體。

2. 2 肝片吸蟲CatB4基因及其編碼蛋白的分子特征分析結果

將測序得到的肝片吸蟲CatB4基因cDNA序列與GenBank中的肝片吸蟲CatB4基因序列進行比對分析，發現其核苷酸序列同源性為99.43%。在線分子生物信息學軟件分析結果顯示，CatB4蛋白等電點（pI）7.95，理論分子質量25.89 kD;CatB4蛋白無信號肽和跨膜區，屬于非分泌性蛋白。Motif Scan預測發現，CatB4蛋白存在10個潛在的磷酸化位點、2個N-糖基化位點和7個N-肉豆蔻酰化位點;Antigen Prediction Tool預測結果顯示，CatB4蛋白有9個抗原決定簇。CatB4蛋白具有高度保守的CatB結構域，是由無規則卷曲連接9個α-螺旋和8個β-折疊構成其空間結構?；贑atB4基因核苷酸序列同源性構建的系統發育進化樹（圖3）顯示，肝片吸蟲和大片吸蟲聚為一支，二者的親緣關系最近，同源性為83.98%;而與其他寄生蟲的親緣性相對較遠。

2. 3 原核表達載體pET-CatB4的雙酶切鑒定結果

重組質粒pET-CatB4用BamH I和Xho I進行雙酶切，酶切產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別得到一條699 bp的目的條帶和一條5900 bp的載體片段（圖4），與預期結果相符，表明CatB4基因已成功插入pET-32a（+）表達載體。

2. 4 融合蛋白CatB4的誘導表達、純化及鑒定結果

SDS-PAGE檢測結果顯示，IPTG誘導獲得的融合蛋白在41.80 kD處有一條特異性條帶，與預期的蛋白分子質量大小一致;而以IPTG誘導的pET-32a（+）空載體和重組菌上清液均未獲得特異性條帶（圖5），表明CatB4蛋白主要以包涵體的形式表達。經鎳離子親和層析柱純化后僅檢測到單一的目的條帶，與理論值大小相符。Western blotting分析結果也顯示，在41.80 kD處檢測到目的條帶，與預期結果相符，表明誘導表達獲得的融合蛋白CatB4可與綿羊肝片吸蟲陽性血清發生特異性反應。

2. 5 融合蛋白CatB4的免疫組化定位分析結果

綿羊肝片吸蟲IgG抗體ELISA檢測試劑盒檢測發現，以純化融合蛋白CatB4與弗氏佐劑乳化后免疫的小鼠均可產生特異性抗體，證實融合蛋白CatB4具有較強的免疫原性。免疫組化定位分析結果顯示，在肝片吸蟲的卵黃腺腺體細胞（圖6-A）、排泄管上皮細胞（圖6-B）、腸道上皮細胞（圖6-C）和卵黃腺管上皮細胞（圖6-D）均發生特異性的抗原抗體反應，呈深棕色;而陰性對照組未發生反應（圖6-E和圖6-F），證實CatB4蛋白主要在肝片吸蟲的分泌組織細胞內高度表達。

3 討論

肝片吸蟲病是人畜共患寄生蟲病，感染宿主范圍較廣，人類、家畜及嚙齒動物均可被感染（何山紅等，2010）。牛、羊等草食動物是肝片吸蟲感染的重要宿主，特別是在我國一些牧區肝片吸蟲病的感染率和發病率較高，其化學藥物治療效果不理想，因此加強家畜肝片吸蟲病疫苗研發至關重要。近年來，國內外已開展大量肝片吸蟲亞單位疫苗候選抗原的相關研究，并分析了不同抗原對宿主的保護作用。研究證實，肝片吸蟲硫氧還蛋白—谷胱甘肽還原酶可使兔體內肝片吸蟲量降低96.7%（Maggioli et al.，2011），CatL可對牛產生47%～63%的免疫保護（Weso?owska et al.，2018），而脂肪酸結合蛋白對犢牛和綿羊的免疫保護率分別為23.0%和43.0%（López-Abán et al.，2007;Kumar et al.，2012）。

目前，已有研究證實ESP對肝片吸蟲在宿主體內的寄生具有多種調節作用。一方面，ESP可對宿主淋巴細胞產生免疫刺激和毒性作用，引起肝細胞凋亡，還可誘導單核細胞抑制抗蠕蟲過敏反應（Cervi et al.，1996;B?ska et al.，2013）;另一方面，ESP能抑制宿主分泌NO和腹腔吞噬細胞對蟲體的黏附、吞噬作用，幫助蟲體實現免疫逃避（Flynn and Mulcahy，2008），增強宿主Th2反應的同時抑制Th1反應（Hillyer，2005）。CatB作為肝片吸蟲產生的一種重要ESP，其生物學特性和功能至今尚未得到深入研究。CatB在蟲體內的表達具有時空性，可能是通過切割宿主抗體或阻止免疫效應分子使肝片吸蟲逃避宿主免疫應答（Creaney et al.，1996）。同時，CatB家族成員具有良好的免疫原性，可誘導感染宿主產生特異性免疫應答反應。Jayaraj等（2009）以肝片吸蟲CatB和CatL5分別免疫大鼠，結果發現CatB可獲得60.0%的減蟲率，當兩個蛋白聯合免疫時保護率可達83.0%，說明CatB和CatL單獨免疫或聯合免疫均可對大鼠產生免疫保護作用，但聯合免疫的保護效果更佳。Chantree等（2013）研究發現，小鼠免疫大片吸蟲CatB2和CatB3蛋白2周后，其體內總IgG含量顯著升高，且在感染囊蚴后IgG總量高水平保持4周。Weso?owska等（2018）以rFhCatL3-1和rFhCatL3-2分別免疫大鼠，結果使大鼠的肝片吸蟲量分別降低47.0%和63.0%，用rFhCatL3-1/CatL3-2/CatB3制成的三價疫苗與rFhCatL3-2相比，其保護作用未見明顯提高，但可有效降低肝片吸蟲對大鼠肝臟的損傷;同時證實通過滴鼻免疫CatL5和CatB2二價重組蛋白亞單位疫苗能降低綿羊體內的載蟲量，即肝片吸蟲CatB具有作為亞單位疫苗候選抗原的潛力。本研究對肝片吸蟲CatB4基因進行克隆表達后經免疫組化分析，結果發現CatB4蛋白主要在肝片吸蟲成蟲分泌組織細胞內大量表達，表明CatB4是肝片吸蟲成功入侵和寄生過程中的一種重要蛋白。

CatB家族的大部分成員主要在肝片吸蟲童蟲階段分泌表達，但也有部分CatB蛋白可在成蟲階段表達，與CatL在蟲體的寄生過程中起協同作用（李曉娟，2009），提示CatB蛋白可能在成蟲蟲體移行、寄生和免疫逃避過程中發揮重要作用。為此，本研究對肝片吸蟲CatB4基因進行克隆及原核表達，結果證實誘導表達獲得的融合蛋白CatB4可與肝片吸蟲陽性血清發生特異性反應，即有較強的免疫原性，且CatB4蛋白主要在肝片吸蟲成蟲卵黃腺及腸管上皮細胞中表達，該結論為進一步研究肝片吸蟲CatB4蛋白的生物學特性及其致病機理打下基礎。

4 結論

誘導表達獲得的融合蛋白CatB4可特異性識別綿羊肝片吸蟲陽性血清，具有較強的免疫原性，且主要在肝片吸蟲分泌排泄組織器官中表達，說明CatB4蛋白具有作為肝片吸蟲候選抗原的潛力。

參考文獻：

何山紅，班克滿，郭亞芬，楊豐利，韋英明. 2010. 廣西欽州市郊區水牛大片吸蟲感染情況調查分析[J]. 廣西農業科學，41（11）：1237-1239. [He S H，Ban K M，Guo Y F，Yang F L，Wei Y M. 2010. Status of Fasciola gigantica infection in buffaloes in Qinzhou suburb of Guangxi[J]. Guangxi Agricultural Sciences，41（11）：1237-1239.]

黎萬奎，陳幼竹，周宇，徐恒. 2003. 肝片吸蟲抗原基因轉基因苜蓿再生的研究[J]. 四川大學學報（自然科學版），40（1）：144-147. [Li W K，Chen Y Z，Zhou Y，Xu H. 2003. Regeneration of F. hepatica protective antigenic gene transgenic alfalfa plants by agrobacterium mediated gene transfer[J]. Journal of Sichuan University（Natural Science Edition），40（1）：144-147.]

李曉娟. 2009. 肝片吸蟲重組GST、CatL蛋白及其DNA核酸聯合免疫初步研究[D]. 大慶：黑龍江八一農墾大學. [Li X J. 2009. Preliminary study on combination immunization with recombinant proteins and DNA nucleicacids of GST and CatL genes of Fasciola hepatica[D]. Daqing：Heilongjiang Bayi Agricultural University.]

田艾靈，朱興全，黃思揚. 2017. 片形吸蟲排泄分泌產物的研究進展[J]. 畜牧獸醫學報，48（2）：201-206. [Tian A L，Zhu X Q，Huang S Y. 2017. Research advance in excretory-secretory products of Fasciola spp[J]. Acta Veterina-ria et Zootechnica Sinica，48（2）：201-206.]

王熙鳳，孟慶玲，喬軍，陳英，鐘文強，貢莎莎，黃運福，才學鵬. 2018. 肝片吸蟲Ftn-1蛋白分子特征、抗原性及其抗體制備[J]. 河南農業科學，47（2）：119-124. [Wang X F，Meng Q L，Qiao J，Chen Y，Zhong W Q，Gong S S，Huang Y F，Cai X P. 2018. Molecular characterization，antigenicity and antibody preparation of Ftn-1 protein of Fasciola hepatica[J]. Journal of Henan Agricultural Scien-ces，47（2）：119-124.]

Ashrafi K，Valero M A，Peixoto R V，Artigas P，Panova M，Mas-Coma S. 2015. Distribution of Fasciola hepatica and F. gigantica in the endemic area of Guilan，Iran：Relationships between zonal overlap and phenotypic traits[J]. Infection，Genetics and Evolution，31：95-109.

B?ska P，Norbury L J，Wi?niewski M，Januszkiewicz K，W?drychowicz H. 2013. Excretory/secretory products of Fasciola hepatica but not recombinant phosphoglycerate kinase induce death of human hepatocyte cells[J]. Acta Parasitologica，58（2）：215-217.

Beckham S A，Piedrafita D，Phillips C I，Samarawickrema N，Law R H，Smooker P M，Quinsey N S，Irving J A，Greenwood D，Verhelst S H，Bogyo M，Turk B，Coetzer T H，Wijeyewickrema L C，Spithill T W，Pike R N. 2009. A major cathepsin B protease from the liver fluke Fasciola hepatica has atypical active site features and a potential role in the digestive tract of newly excysted juvenile para-sites[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，41（7）：1601-1612.

Cancela M，Acosta D，Rinaldi G，Silva E，Durán R，Roche L，Zaha A，Carmona C，Tort J F. 2008. A distinctive repertoire of cathepsins is expressed by juvenile invasive Fasciola hepatica[J]. Biochimie，90（10）：1461-1475.

Cervi L，Rubinstein H，Masih D T. 1996. Involvement of excretion-secretion products from Fasciola hepatica indu-cing suppression of the cellular immune responses[J]. Ve-terinary Parasitology，61（1-2）：97-111.

Chantree P，Phatsara M，Meemon K，Chaichanasak P，Changklungmoa N，Kueakhai P，Lorsuwannarat N，Sangpairoj K，Songkoomkrong S，Wanichanon C，Itagaki T，Sobhon P. 2013. Vaccine potential of recombinant cathepsin B against Fasciola gigantica[J]. Experimental Parasitology，135（1）：102-109.

Creaney J，Wilson L，Dosen M，Sandeman R M，Spithill T W，Parsons J C. 1996. Fasciola hepatica：Irradiation-induced alterations in carbohydrate and cathepsin-B protease expression in newly excysted juvenile liver fluke[J]. Experi-mental Parasitology，83（2）：202-215.

Cwiklinski K，Dalton J P，Dufresne P J，La Course J，Wi-lliams D J，Hodgkinson J，Paterson S. 2015. The Fasciola hepatica genome：Gene duplication and polymorphism reveals adaptation to the host environment and the capacity for rapid evolution[J]. Genome Biology，16：71.doi：10. 1186/s13059-015-0632-2.

Flynn R J，Mulcahy G. 2008. Possible role for Toll-like receptors in interaction of Fasciola hepatica excretory/secretory products with bovine macrophages[J]. Infection and Immunity，76（2）：678-684.

Hillyer G V. 2005. Fasciola antigens as vaccines against fascioliasis and schistosomiasis[J]. Journal of Helminthology，79（3）：241-247.

Jayaraj R，Piedrafita D，Dynon K，Grams R，Spithill T W，Smooker P M. 2009. Vaccination against fasciolosis by a multivalent vaccine of stage-specific antigens[J]. Veterinary Parasitology，160（3-4）：230-236.

Kumar N，Anju V，Gaurav N，Chandra D，Samanta S，Gupta S C，Adeppa J，Raina O K. 2012. Vaccination of buffaloes with Fasciola gigantica recombinant glutathione S-transferase and fatty acid binding protein[J]. Parasitology Research，110（1）：419-426.

López-Abán J，Casanueva P，Nogal J，Arias M，Morrondo P，Diez-Ba?os P，Hillyer G V，Martínez-Fernández A R，Muro A. 2007. Progress in the development of Fasciola hepatica vaccine using recombinant fatty acid binding protein with the adjuvant adaptation system ADAD[J]. Vete-rinary Parasitology，145（3-4）：287-296.

Maggioli G，Silveira F，Martín-Alonso J M，Salinas G，Carmona C，Parra F. 2011. A recombinant thioredoxin-glutathione reductase from Fasciola hepatica induces a protective response in rabbits[J]. Experimental Parasitology，129（4）：323-330.

Mas-Coma S，Valero M A，Bargues M D. 2009. Chapter 2. Fasciola，lymnaeids and human fascioliasis，with a global overview on disease transmission，epidemiology，evolutionary genetics，molecular epidemiology and control[J]. Advances in Parasitology，69：141-146.

Meemon K，Sobhon P. 2015. Juvenile-specific cathepsin proteases in Fasciola spp.：Their characteristics and vaccine e-fficacies[J]. Parasitology Research，114（8）：2807-2813.

Robinson M W，Menon R，Donnelly S M，Dalton J P，Ranganathan S. 2009. An integrated transcriptomics and proteomics analysis of the secretome of the helminth pathogen Fasciola hepatica：Proteins associated with invasion and infection of the mammalian host[J]. Molecular & Cellular Proteomics，8（8）：1891-1907.

Robinson M W，Tort J F，Lowther J， Donnelly S M，Wong E，Xu W，Stack C M，Padula M，Herbert B，Dalton J P. 2008. Proteomics and phylogenetic analysis of the cathepsin L protease family of the helminth pathogen Fasciola hepatica：Expansion of a repertoire of virulence-associated factors[J]. Molecular & Cellular Proteomics，7（6）：1111-1123.

Weso?owska A，Basa?aj K，Norbury L J，Sielicka A，W?drychowicz H，Zawistowska-Deniziak A. 2018. Vaccination against Fasciola hepatica using cathepsin L3 and B3 proteases delivered alone or in combination[J]. Veterinary Parasitology，250：15-21. doi：10.1016/j.vetpar.2017.12.007.

（責任編輯 蘭宗寶）