大鼠體內的葛根素濃度及藥代動力學

關彩華 招志輝 張韻

摘要 目的：評價大鼠體內葛根素濃度及藥代動力學，為臨床葛根素用藥方案制定選擇提供參考。方法：建立葛根素在大鼠體內濃度測定方法，采用該方法進行葛根素藥代動力學實驗室研究，分析文獻報道的高效液相色譜（HPLC）分析法檢測葛根素含量方法，制定色譜條件：色譜柱：AcclaimC18色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），流動相：甲醇：水，檢測器：Modle 500 UV檢測器;檢測波長：250 nm，色譜工作站：N2000雙通道工作站。配制葛根素標準液、外標物溶液、待測血漿樣品液、空白對照液等。分別進樣行梯度洗脫，驗證方法的專屬性、線性關系、回收率、精密度、穩定性。選擇12只潔凈大鼠，雌雄各半，隨機分為2組，將采用藥典葛根素推薦劑量下限給予腹腔灌胃設為低劑量組，給予藥典推薦劑量上線腹腔灌胃設為高劑量組。2組大鼠分別于灌胃后不同時間采集眼眶靜脈血，采用已驗證的HPLC分離檢測方法檢測血漿葛根素藥物濃度，采用DAS2.0統計軟件處理葛根素濃度-時間數據，繪制藥時曲線圖，計算藥代動力學指標并行組間比較。結果：1）擬定色譜條件下，大鼠血漿空白溶液、葛根素對照溶液、葛根素血漿樣品溶液中主要成分保留時間差異明顯，未發生重疊，說明該方法專屬性較好。2）加入不同濃度葛根素對照品于大鼠血漿中，所得濃度-峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為：Y=3.957×106X-697.329，r=0.998 3，檢測限：0.055～0.660 μg/mL。不同濃度葛根素對照品回收率為（103.110±0.521）%，高濃度和低濃度2組回收率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。日內精密度為：3.14%，日間精密度5.26%;12 h內，放置不同時間的樣品間葛根素含量檢測相對偏差（RSD）為3.95%;不同灌胃劑量大鼠藥時曲線均符合二室模型;大鼠灌胃葛根素后，不同劑量大鼠的AUC0-t、Cmax、MRT0-t、CL差異有統計學意義（P<0.05）。結論：采用HPLC檢測大鼠體內葛根素方法可行，采用低劑量用藥方案即可獲得較好的藥物吸收代謝效果，高劑量則影響葛根素吸收。

關鍵詞 葛根素;結晶大鼠;高效液相色譜法;方法驗證;藥代動力學;臨床用藥指導;臨床價值

Abstract Objective：To establish a method for concentration determination of puerarin in rats，and to study pharmacokinetics of puerarin in laboratory by this method，and to provide reference for formulation and selection of clinical puerarin medication scheme.Methods：Methods for determination of puerarin content by high performance liquid chromatography（HPLC）reported in literature were analyzed.Chromatographic conditions were established.Chromatographic column：Acclaim C18 chromatographic column（5 μm，4.6 mm×150 mm）; mobile phase：methanol：water; detector：Modle 500 UV detector; detection wavelength：250 nm; chromatographic workstation：N2000 dual channel workstation.Puerarin standard solution，external standard solution，plasma sample solution for detection and blank control solution and other solutions were prepared.Gradient elution was used respectively.Specificity，linear relationship，recovery rate，precision and stability of the methods were validated.Twelve clean rats，half male and half female，were randomly divided into 2 groups.The group treated by intraperitoneal administration and gavage with lower limit of recommended dose of puerarin in the pharmacopoeia was taken as low dose group，and the group treated by intraperitoneal administration and gavage with upper limit of recommended dose of puerarin in the pharmacopoeia was taken as high dose group.Orbital venous blood was collected immediately，0.25 h，0.5 h，0.75 h，1 h，1.5 h，2 h，4 h，6 h and 8 h after the gavage.Plasma puerarin concentration was detected by the validated method of HPLC separation and detection.Concentration-time data of puerarin were processed by DAS 2.0 software.Drug-time curves were drawn and pharmacokinetic index was calculated and compared between the groups.Results：1）Under the proposed chromatographic conditions，retention time of main components in rat plasma blank solution，puerarin control solution and puerarin plasma sample solution was significantly different，and no overlap occurred，indicating that the method was specific.2）Different concentrations of puerarin control products were added into rat plasma，and there was a good linear relationship between the concentration and peak area.The regression equation was Y=3.957×106X-697.329，r=0.998 3; detection limit was 0.055～0.660 μg/mL.3）Recovery rate：the recovery rate of puerarin control products in different concentrations was（103.110±0.521）%，and there was no significant difference in the recovery rate between the high dose group and the low dose group（P>0.05）.4）Precision：intraday precision was 3.14%，and day to day precision was 5.26%.5）Stability：within 12 h，relative deviation（RSD）of puerarin content between samples placed at different times was 3.95%.6）The drug-time curves of rats with different doses of gavage conformed to two-compartment model.7）After the gavage of puerarin，the AUC0-t，Cmax，MRT0-t and CL of rats with different doses were significantly different（P<0.05）.Conclusion：It is feasible to detect puerarin in rats by high performance liquid chromatography.Good efficacy of drug absorption and metabolism can be achieved by using low dose medication scheme，while high dose can affect puerarin absorption.565BAB24-E58C-4B62-BC45-301E26F8074C

Key Words Puerarin; Clean rats; High performance liquid chromatography; Method validation; Pharmacokinetics; Clinical medication guidance; Clinical value; Research

中圖分類號：R284 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.10.014

葛根素（Puerarin）為豆科植物葛根中的主要有效成分。葛根為經典的解肌中藥材，味甘、性辛，涼，其功效以解肌退熱，透疹，生津止渴，升陽止瀉為主，臨床用于表證發熱，項背強痛，麻疹不透，熱病口渴，陰虛消渴，熱瀉熱痢，脾虛泄瀉等中醫病證[1]。在《本草經疏》中有對葛根功效的描述：“葛根，解散陽明溫病熱邪主要藥也，故主消渴，身大熱，熱壅胸膈作嘔吐。發散而升，風藥之性也，故主諸痹”。顯示葛根善治各種痹證?！秳e錄》：療傷寒中風頭痛，解肌發表出汗，開腠理，療金瘡，止脅風痛。現代藥理實驗顯示，葛根的主要有效部位為異黃酮類衍生物，動物實驗及臨床實驗均具有明確的擴冠、鎮靜的作用。精制提純的葛根素相關制劑常用于退熱、鎮靜、增加冠脈流量、保護因垂體后葉素導致的急性心肌出血[2-3]，并廣泛用于臨床高血壓、冠心病心絞痛患者的救治[4]。目前市售含葛根素的中成藥制品較多，尤其是用于治療高血壓、冠心病慢性病的制劑[5-6]。但由于葛根素相關制品屬傳統中成藥，不同藥品廠家對于不同給藥途徑、用藥方案的葛根素相關制品的藥代動力學數據尚不完善，臨床醫生用藥缺乏科學依據?；诖?，本研究擬建立高效液相色譜法（HPLC）測定大鼠體內葛根素含量的方法，并采用該方法對葛根素在大鼠體內的藥代動力學情況進行分析，為臨床葛根素的用藥方案選擇提供參考?，F將結果報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀：日本島津LC-20A高效液相色譜儀，搭配T進樣泵，SPD-20A紫外檢測器，色譜柱：Acclaim C18色譜柱，規格：孔徑5 μm，尺寸：4.6 mm×150 mm，色譜工作站：島津工作站，島津LabSolutions工作站，玻璃器皿、超聲振蕩器、過濾系統、電子秤等為本實驗室常規配制。

1.2 實驗動物 SD大鼠購自長沙市天勒生物技術有限公司，雌雄各半，體質量為（220±20）g。

1.3 試劑試藥 葛根素對照品：購自中國標準物質網：產品編號：3681-99-0，規格：20 mg/支，含量：Puerarin HPLC 98%（批號：110752-200912）。甲醇為色譜級，購自天津市康科德科技有限公司，水為實驗室自制重蒸餾水。

1.4 供試品 葛根素由本實驗室自制，經水提醇沉、分析柱分離精制得到。葛根鑒定由天津市藥檢所中藥室鑒定為藥典用品種。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 分析文獻報道的葛根素血漿濃度高效液相色譜（HPLC）檢測方法，制定色譜條件：色譜柱：Acclaim C18色譜柱，規格：孔徑5 μm，尺寸：4.6 mm×150 mm;流動相：甲醇：水（1：4），檢測器：SPD-20AUV檢測器;檢測波長：250 nm，色譜工作站：島津LabSolutions工作站，進樣量：10 μL，流動相流速：1 mL/min，柱溫：室溫。

2.2 葛根素對照品溶液配制 采用減重法精密稱取葛根素對照品10.000 mg，置于50 mL容量瓶中，加入色譜級甲醇約25 mL，充分振搖后，置于超聲振蕩器中助溶5 min，取出振搖，甲醇定容至刻度充分振搖均勻制成葛根素貯備液，保存于-20 ℃備用。分別用0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL大肚吸管精密吸取葛根素貯備液至25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制作成葛根素系列濃度的標準液。

2.3 大鼠血漿空白樣品配制 大鼠未灌胃葛根素前，采集大鼠眼眶靜脈血樣與肝素抗凝管中，以3 000 r/min、5 cm半徑離心15 min，取0.2 mL上清液于裝有2 mL甲醇溶液的離心管中，振搖混合，以3 000 r/min、半徑5 cm離線15 min，取上清液與蒸發皿中，置于干燥箱中得殘渣，取出殘渣加入0.2 mL甲醇置于超聲振蕩器中助溶，經0.45 μm濾膜過濾得血漿空白樣品溶液，按照葛根素大鼠血漿樣品配制方法配制大鼠血漿空白液。

2.4 葛根素大鼠血漿樣品制備 精密吸取大鼠空白血漿溶液100 μL，置于1.5 mL離心管中，精密添加10 μL葛根素標準溶液充分混合均勻，加入1 mL乙酸乙酯，混合均勻，以3 000 r/min、5 cm半徑離心15 min。取上層有機層于蒸發皿中，采用氮氣吹干，想蒸發皿中加入100 μL流動相復溶，離心得葛根素血漿樣品。

2.5 生物樣品制備 選擇12只潔凈大鼠，雌雄各半，隨機分為2組，將采用藥典葛根素推薦劑量下限給予腹腔灌胃設為低劑量組（100 mg/kg），將給予藥典推薦劑量上線腹腔灌胃設為高劑量組（300 mg/kg）。2組大鼠分別于灌胃后即刻、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h次采集眼眶靜脈血，按照2.4向下方法制備供試品溶液。

2.6 專屬性驗證 取12只大鼠空白血漿混合后制作成大鼠血漿空白溶液6份，每份100 μL，每份樣品采用自動進樣器進樣10 μL，按照色譜條件進行洗脫、檢測、數據分析，得到大鼠血漿空白樣品色譜圖。見圖1。葛根素對照溶液進樣檢測得到葛根素對照品色譜圖。見圖2。葛根素對照品溶液加入大鼠空白血漿中振搖混勻定容，進樣10 μL得到樣品血漿色譜圖。見圖3。大鼠血漿空白溶液、葛根素對照溶液、葛根素血漿樣品溶液中主要成分保留時間差異明顯，未發生重疊，說明該方法專屬性較好。565BAB24-E58C-4B62-BC45-301E26F8074C

2.7 線性關系驗證 精密吸取大鼠血漿空白溶液100 μL共計8份分別于25 mL容量瓶中，按照順序分別加入葛根素對照溶液標準系列溶液，定容至刻度，制成系列濃度的葛根素血漿供試品溶液。按色譜條件逐一進樣10 μL，洗脫、檢測、數據處理得到系列色譜圖。以葛根素濃度為橫坐標、葛根素峰面積為縱坐標繪制線性關系圖，得到回歸方程為：Y=3.957×106X-697.329，r=0.998 3，檢測限：0.055～0.660 μg/mL。

2.8 回收率試驗 取大鼠血漿空白溶液100 μL共6份分別于于50 mL容量瓶中，分成2組，一組加入100 mg/mL濃度的葛根素對照品溶液，另一組加入300 mg/mLl葛根素對照品溶液，按照2.4項下供試品溶液制備方法制成葛根素測試液。分別按照2.1項下色譜條件檢測得到樣品中含量檢測結果。取上述2組溶液各100 μL，分別按照對應濃度加入葛根素100 mg/mL對照溶液、300 mg/mL對照溶液，按照2.1項下色譜條件進樣檢測，根據2次檢測結果及加樣結果計算葛根素回收率。試驗結果，不同濃度葛根素對照品回收率為（103.110±0.521）%，高濃度和低濃度2組回收率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1、表2。

2.9 精密度驗證 精密吸取濃度約20 μg/mL葛根素對照品溶液10 μL，分別在在2，1色譜條件下連續進樣6次，計算每次檢測得到的葛根素濃度，計算6次檢測結果的日內RSD值，上述濃度的葛根素對照品溶液，分別于3 d內每天取10 μL進樣檢測，根據測得的葛根素濃度結果，計算日間RSD值。日內精密度為：3.14%，日間精密度5.26%。RSD均低于10%，說明整個色譜系統及操作方法具有較好的精密度。

2.10 穩定性驗證 取一份葛根素供試樣品溶液，具塞放于室溫環境，在12 h內，分別每隔2 h進樣檢測1次，計算每次檢測結果葛根素濃度，計算6份樣品測試結果間的RSD值。12 h內，放置不同時間的樣品間葛根素含量檢測RSD為3.95%;說明葛根素溶液在12 h內穩定性較好。

2.11 大鼠葛根素藥代動力學指標研究 2組大鼠分別于灌胃后即刻、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h次采集眼眶靜脈血，按照2.4方法制備供試品溶液。采用已驗證的HPLC分離檢測方法檢測生物血漿葛根素藥物濃度，采用DAS2.0統計軟件處理葛根素濃度-時間數據，繪制藥時曲線圖，計算藥代動力學指標并行組間比較。不同灌胃劑量大鼠藥時曲線均符合二室模型。大鼠灌胃葛根素后，不同劑量大鼠的AUC0-t、Cmax、MRT0-t、CL差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

隨著對葛根中藥材藥效學、藥理學、毒理學研究的不斷深入，葛根素的臨床應用日趨廣泛。各種不同的葛根素制劑如雨后春筍般出現。素葛根素注射液、葛根素提取的有效部位制成的各種片劑、緩釋劑、控釋劑、納米制劑種類繁多，成為藥物研究的熱點[7]。葛根素目前廣泛應用于心腦血管疾病的治療和預防，絕大部分患者需要長期用藥。近年來，葛根素相關制劑藥物不良反應報道呈上升趨勢，可能因為長期服用葛根素后在體內蓄積，對機體產生了一定的不良反應[8-9]。掌握葛根素在體內的吸收、分布、代謝、排泄過程相關數據，是臨床醫師擬定用藥方案最為重要的基礎參考數據，是保證藥品技能發揮應有療效，又能確保用藥安全的基礎[10-11]。過量過快應用葛根素可能導致的藥物不良反應主要有：過敏反應（藥物熱、皮疹、過敏性哮喘、過敏性休克）、溶血性貧血（腰痛、排尿困難和血尿），臨床有因溶血性貧血致死病例報道。葛根素對機體肝、腎損害也有報道[12-13]。而過低劑量可能不能保證藥物治療效果。對葛根素在體內的藥代動力學情況進行研究，指導臨床用藥顯得尤為重要。

高效液相色譜法（HPLC）是臨床廣泛應用的一種中藥材及其制品的質量分析方法。因為中藥材及其制品成分復雜，常規的光學檢測技術檢測需要所分析的成分有特異性的吸收波長，HPLC通過固液相極性差異對不同極性的成分進行分離，連接相應的檢測器，在特定波長處檢出處不同特性的成分，從而對所需要控制的有效成分含量進行檢測[14]。中藥現代化的指紋圖譜以HPLC為最主要的檢測手段，也可連用氣相色譜、質譜等分離效果更好、檢測更為精確的儀器作為檢測手段[15-16]。

大鼠體內葛根素含量檢測方法尚無國家標準，本研究根據臨床文獻[17-18]及自身多年應用HPLC分析中藥及其相關之際的經驗，擬定色譜條件，并對其進行方法學驗證，結果顯示，本方案擬定的色譜條件具檢測大鼠體內葛根素濃度，具有較好的專屬性、線性關系良好;同時具有較高的回收率、精密度、穩定性。按照藥代動力學試驗常規，對大鼠給予不同劑量的葛根素，結果顯示，大鼠灌胃低劑量葛根素后，其AUC0-t、Cmax明顯高于高劑量組大鼠，而MRT0-t、CL明顯低于高劑量大鼠。其他藥動學指標比較，差異無統計學意義。分析AUC0-t、Cmax是藥物吸收程度的指標，小劑量組大鼠此兩指標均高于高級2組大鼠，說明低劑量葛根素具有更好的吸收效果。而MRT0-t、CL時間長說明在體內消除速率較慢，藥效時間更長。上述結果說明，低劑量給藥方案在發揮藥效方面更具優勢，這一結果與文獻[19]的研究結果一致。

綜上所述，采用HPLC檢測大鼠體內葛根素方法可行，采用低劑量用藥方案即可獲得較好的藥物吸收代謝效果，高劑量則影響葛根素吸收。

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（2018-11-30收稿 責任編輯：楊覺雄）565BAB24-E58C-4B62-BC45-301E26F8074C