雷公藤甲素對糖尿病腎病小鼠腎足細胞自噬及調(diào)亡的影響

唐小鐵 徐潔 王麗媛

摘要 目的：探討雷公藤甲素對糖尿病腎病（DN）小鼠腎足細胞自噬及調(diào)亡的影響。方法：選擇小鼠60只，隨機分為DN組和雷公藤甲素組各30只，光鏡下觀察各組腎組織病理學改變情況，觀察腎功能變化情況，對其行行威廉姆斯腫瘤蛋白1（WT-1）免疫組化染色，觀察足細胞情況，透射電鏡觀察足細胞自噬情況，采用Western blot法檢測腎組織中Podocin、Lc3、Bax及Caspase-3的表達情況。結(jié)果：PAS染色結(jié)果顯示，DN組小鼠系膜基質(zhì)明顯增多，雷公藤甲素組小鼠系膜基質(zhì)明顯減少。WT-1免疫組織化學染色顯示，雷公藤甲素組腎足細胞數(shù)量比DN組明顯增多。Western Blot結(jié)果顯示，與DN組小鼠比較，雷公藤甲素組Podocin表達明顯增加，LC3-II/LC3-I比值明顯上升，凋亡相關(guān)蛋白Bax及Caspase-3表達明顯減少（P<0.05）。結(jié)論：雷公藤甲素可減輕足細胞損傷，延緩DN的進展，可DN的治療起到參考價值。

Abstract Objective：To investigate the effects of triptolide on autophagy and apoptosis of renal podocytes in diabetic nephropathy（DN）mice.Methods：A total of 60 mice were randomly divided into a DN group and a triptolide group，with 30 mice in each group.The pathological changes of kidney tissues and renal function were observed under light microscope.The the expression of podocin，Lc3，Bax and Caspase-3 in kidney tissues were detected by Western blot and immunohistochemical staining of Williams Tumor Protein-1（WT-1）and podocyte autophagy were observed under transmission electron microscope.Results：PAS staining showed that the mesangial matrix increased significantly in DN group and decreased significantly in triptolide group.WT-1 immunohistochemical staining showed that the number of renal podocytes in triptolide group was significantly higher than that in DN group.Western Blot results showed that compared with DN mice，the expression of Podocin，LC3-II/LC3-I ratio，Bax and Caspase-3 in triptolide group increased significantly，while the expression of apoptosis-related proteins decreased significantly（P<0.05）.Conclusion：Tripterygium wilfordii can alleviate podocyte injury and delay the progress of DN，which can be used as a reference for the treatment of DN.

Key Words Diabetic nephropathy; Triptolide; Sertoli cell; Podocin; Bax; Caspase-3; Lc3

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.10.017

糖尿病（Diabetic Mellitus，DM）是最常見的一種慢性疾病，隨著全球環(huán)境污染加重及居民生活飲食習慣改變，DM患病率逐年增高[1-2]。糖尿病腎病（Diabetic Nephropathy，DN）是DM最常見的并發(fā)癥之一，且其早期無明顯臨床狀態(tài)，易被漏診，隨著病情進展，會出現(xiàn)腎功能不全，并最終進展為腎功能衰竭的終末期，患者預后極差[3-4]。在DN早期及時確診，并進行針對性的治療，可及時控制病情發(fā)展，因此預防及治療DN的發(fā)生及發(fā)展意義重大[5]。DN患者腎小球疾病病理改變時，足細胞會出現(xiàn)損傷，若未及時有效治療，將誘發(fā)足細胞凋亡，導致足細胞功能失調(diào)[6]。自噬是一種在DN發(fā)生及發(fā)展過程中起重要作用的防御機制，其可能是足細胞維持自身動態(tài)平衡的重要機制[7]。雷公藤甲素是中藥雷公藤植物根的提取物，可治療多種腎小球疾病[8]。本研究通過觀察雷公藤甲素干預小鼠腎足細胞自噬及調(diào)亡情況，探討其可能的分子機制，為中醫(yī)預防及治療DN提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用8周齡雄性健康小鼠60只，均購于北京華阜康生物科技股份有限公司[動物批準號：SCXK（京）2018-0009]，飼養(yǎng)于清潔級實驗室中在（22±2）℃室溫下，保持敷料干燥，所有小鼠自由攝食飲水攝食，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.1.2 藥物 雷公藤甲素（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，生產(chǎn)批號：180113）。

1.1.3 儀器與試劑 切片機（天津天利航空機電有限公司，型號：OPJ-1B）、電子天平（日本島津，型號：AEL-40SM）、血糖儀（長沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司公司，型號：GA-7）、顯微鏡（日本OLYMPUS，型號：Olympus IX71）、PCR儀（美國Applied Biosystems公司，型號：Step One Plus Real-Time）、電泳儀（美國Bio-Rad公司，型號：Bio-RaD）;兔抗小鼠Bax抗體（生產(chǎn)批號：20180407）及Lc3抗體生產(chǎn)批號：20180311）均購于上海研謹生物科技有限公司、Podocin抗體（美國Santa Cruz公司，生產(chǎn)批號：20180208）、Caspase-3活性測定試劑盒（北京奧維亞生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：20180412），鏈尿佐菌素（STZ）（美國Sigma公司，生產(chǎn)批號：20180203），尿白蛋白測定試劑盒（生產(chǎn)批號：20180315）和尿肌酐測定試劑盒（生產(chǎn)批號：20180322）購于美國Exocell公司，Western blot及凝膠電泳試劑（南京凱基生物有限公司，生產(chǎn)批號：20180213）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將60只健康小鼠采用隨機數(shù)字表法分為DN組和雷公藤甲素組，每組30只。禁食但不禁水12 h后，對小鼠注射STZ（55 mg/kg），連續(xù)注射1周，檢測小鼠空腹血糖，當空腹血糖≥13.8 mmol/L，則DM模型構(gòu)建成功。

1.2.2 干預方法 雷公藤甲素組給予200 μg/（kg·d）劑量的雷公藤甲素灌胃，DN組給予等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃，2組小鼠均連續(xù)12周。

1.2.3檢測指標與方法

1.2.3.1 小鼠腎組織形態(tài)學觀察 12周后將各組小鼠麻醉后，頸椎脫臼法處死后，取腎臟組織切成小塊，0.3%戊二醛和1%的四氧化鋨進行固定，梯度丙酮脫水進行石蠟包埋，切片機切片（厚度5 μm），然后PAS染色，鏡下觀察染色情況，腎小球基膜、系膜基質(zhì)及纖維蛋白等呈紫紅色即為PAS陽性物質(zhì)，細胞核呈淺藍色。

1.2.3.2 足細胞數(shù)量變化觀察 采用WT1免疫組織化學染色法觀察足細胞數(shù)量變化情況：取腎臟組織切成小塊，石蠟包埋，切片機切片（厚度2 μm），檸檬酸鹽高溫修復，加入滴加一抗WT1（稀釋比例1∶ 500），4 ℃下過夜后，加入二抗（1∶ 1 000稀釋），20 ℃下孵育15 min，取DBA試劑盒中的A、B、C試劑加至切片顯色，顯色后用純凈水洗掉，終止顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，從各組腎組織切片選取30個完整腎小球，光鏡進行觀察，并對WT1陽性細胞和足細胞計數(shù)。

1.2.3.3 足細胞自噬情況觀察 12周后將各組小鼠麻醉后，頸椎脫臼法處死后，剪取其少量腎皮質(zhì)，放入冷處理后的2.5%戊二醛中固定，并在固定液中將組織切成小塊（約1 mm3），PBS漂洗3次后，1%餓酸固定1 h，PBS再漂洗3，采用90%丙酮（30%、50%、70%、80%、90%、100%）進行梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片機切片（60 nm），檸檬酸鉛染色后dd H2O沖洗3次，醋酸鈾染色，透射電鏡下觀察腎小球足細胞自噬情況。

1.2.3.4 Podocin、Lc3、Caspase-3、Bax表達情況 ? 采用Western-blot法檢測小鼠腎組織中Podocin、Lc3、Caspase-3、Bax表達情況：采用改良異硫氰酸胍法提取總蛋白，-80 ℃下凍存，將總蛋白溶入等體積的緩沖液中煮沸10 min，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離蛋白，然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，然后在封閉液中搖動1 h，加入一抗（稀釋度：Podocin、Lc3、Bax及Caspase-3均為1∶ 500）孵育，4 ℃下過夜。二抗孵育（1∶ 2 000稀釋）2 h，免疫熒光增強法顯色，Podocin、Lc3、Bax及Caspase-3蛋白的表達量與β-actin的灰度比值表示。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，不同組間比較采用F檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組小組腎組織形態(tài)情況 PAS染色結(jié)果顯示，DN組小鼠系膜基質(zhì)明顯增多。見圖1A。雷公藤甲素組小鼠系膜基質(zhì)明顯減少。見圖1B。

2.2 不同組小鼠足細胞數(shù)量及自噬情況 WT1免疫組織化學染色結(jié)果顯示，雷公藤甲素組小鼠足細胞數(shù)量明顯比DN組小鼠增加。見圖2。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，DN組小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷比雷公藤甲素組明顯，且呈空泡樣變。見圖3A、圖3C。自噬體數(shù)量明顯比雷公藤甲素組減少。見圖3B、圖3D。

2.3 不同組小鼠腎組織Podocin、Lc3、Bax及Caspase-3蛋白的表達情況 與DN組比較，雷公藤甲素組Podocin表達明顯增加，LC3-II/LC3-I比值明顯上升，凋亡相關(guān)蛋白Bax及Caspase-3表達明顯減少（P<0.05）。見表1，圖4。

3 討論

中醫(yī)學認為，DN屬于消渴證范疇，患者在“消渴癥，水腫”作用下，會傷及腎絡腎體，從而引起腎臟功能的失調(diào)，其基本病機為本虛標實，其中本虛為五臟陰陽氣血虛虧，腎為之根本，標實為濕阻、痰凝、血瘀，毒氣瘀結(jié)，傷及腎絡[9-10]。腎小球足細胞是一種終末分化細胞，是腎小球濾過膜的最后屏障，但其再生能力非常有限，在DM等應激因素的影響下，DN患者體內(nèi)大量受損的細胞器及蛋白積聚在足細胞內(nèi)，對其產(chǎn)生毒性作用，導致足細胞損傷，并發(fā)生凋亡，因此DN進展的明顯特點為足細胞減少，足細胞損傷是其明顯的標志[11-12]。

DN早期會出現(xiàn)足細胞損傷情況，并貫穿于DN生理病理整個活動過程中[13]。本研究結(jié)果顯示，DN組小鼠系膜基質(zhì)明顯增多，雷公藤甲素組小鼠系膜基質(zhì)明顯減少，說明DM小鼠腎臟組織存在較嚴重的病理損傷。雷公藤甲素具有抗炎及免疫抑制等作用，炎性反應會貫穿于DN發(fā)展過程中，通過雷公藤甲素治療可防止炎性反應過度激活，改善系膜基質(zhì)增生情況，從而改善腎組織損傷。

自噬是細胞在相關(guān)蛋白和基因調(diào)控下維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種生命現(xiàn)象[14]。正常狀態(tài)時，自噬活性水平較低，當受到細胞內(nèi)代謝壓力及細胞外營養(yǎng)成分變化、生長因子等刺激時，其會被大量激活[15]。目前關(guān)于自噬與腎臟疾病的研究是醫(yī)學界的熱點之一，相關(guān)研究表明，自噬對足細胞損傷具有一定保護作用[16]。WT-1是一種足細胞核蛋白，是足細胞特異性標志之一，可反應足細胞數(shù)量變化情況[17]。本研究結(jié)果顯示，DN組小鼠的足細胞數(shù)量明顯比雷公藤甲素組小鼠減少，透射電鏡觀察結(jié)果顯示，雷公藤甲素組自噬體數(shù)量明顯比DN組小鼠增多，DN組小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷明顯，并呈空泡樣變。這是因為DN小鼠在高糖等應激因素刺激下，其足細胞足突會增寬、變短及回縮，從而發(fā)生融合，乃至消失，而足細胞缺失會影響腎小球濾過屏障，導致腎小球硬化。雷公藤甲素可保護并修復DN小鼠腎足細胞損傷，減少足突融合，抑制腎足細胞的凋亡，通過激活腎足細胞自噬活性，從而穩(wěn)定足細胞的功能與結(jié)構(gòu)，達起到保護腎臟的作用。

LC3是公認的自噬體標記蛋白，在自噬中起重要作用，包括LC3-I和LC3-II兩型，其對自噬體膜延長、自噬體膜與其他膜結(jié)構(gòu)的融合及自噬體運載其他物質(zhì)的過程中起到重要的作用[18]。Caspase蛋白是一種在細胞凋亡過程中最易被活化的天冬氨酸蛋白水解酶，在細胞生長、分化等過程中其重要作用[19]。Bax是一種凋亡相關(guān)蛋白，可起到促細胞凋亡作用，其會激活下游Caspase-3并協(xié)同促進細胞凋亡[20-21]。Podocin蛋白是維持足細胞結(jié)構(gòu)與功能的主要分子，可保障腎小球濾過膜的完整性，可作為足細胞損傷的重要標志物[22]。本研究結(jié)果顯示，雷公藤甲素組Podocin表達比DN組明顯增加，LC3-II/LC3-I比值明顯上升，凋亡相關(guān)蛋白Bax及Caspase-3表達明顯減少（P<0.05）。這是因為雷公藤甲素可上調(diào)Podocin蛋白表達，從而維持足細胞結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定，并對Bax蛋白的同二聚體產(chǎn)生進行抑制，將Bax蛋白具備的促細胞凋亡作用阻斷，從而下調(diào)Bax的表達，進而減少Caspase-3的大量激活，從而阻斷足細胞凋亡，同時雷公藤甲素可上調(diào)DN小鼠足細胞自噬水平，并會伴隨LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)換。

綜上所述，對DN小鼠給予雷公藤甲素治療，可減輕足細胞損傷及缺失，維持足細胞的功能和數(shù)量，并保障足細胞的自噬性，可為DN的防治提供的理論依據(jù)。

參考文獻

[1]周海茸，洪忻，王琛琛，等.南京市糖尿病患者社區(qū)自我管理小組活動前后生活質(zhì)量評價[J].中華疾病控制雜志，2018，22（1）：33-37.

[2]周強，陳昊，邵一川，等.糖尿病腎病患者院內(nèi)感染危險因素分析[J].浙江醫(yī)學，2017，39（12）：987-989.

[3]王曉光，譚婷婷，任迪.補脾益腎活血法對糖尿病腎病患者氧化應激水平及炎癥因子的影響？[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2015，16（12）：1063-1067.

[4]Wolf G.New insights into the pathophysiology of diabetic nephropathy： from haemodynamics to molecular pathology[J].Eur J Clin Invest，2004，34（12）：785-796.

[5]楊曉暉，龍泓竹.糖尿病腎臟病的診斷和治療[J].中華全科醫(yī)學，2017，15（6）：915-916.

[6]方錢華，李春君.足細胞自噬與糖尿病腎病[J].國際內(nèi)分泌代謝雜志，2017，37（4）：242-245.

[7]盧新星，范秋靈，徐莉，等.抑制微小RNA-21可減輕高糖誘導的腎小球系膜細胞自噬抑制[J].中華腎臟病雜志，2017，33（1）：48-54.

[8]李亞妤，宋李桃，鄭潔，等.雷公藤甲素對FSGS大鼠臨床療效及腎組織Synaptopodin表達的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（11）：5104-5108.

[9]朱宜臨，錢秋海，張新穎.糖尿病腎病中西醫(yī)研究進展[J].山東中醫(yī)雜志，2017，36（1）：83-85+89.

[10]王嵐，王小琴，韓四萍.Klotho基因多態(tài)性與糖尿病腎病中醫(yī)證候的相關(guān)性分析[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2017，18（7）：596-599.

[11]臧贏君，王利，曹愛麗，等.糖尿病腎病足細胞損傷機制及中藥干預研究進展[J].天津中醫(yī)藥，2017，34（11）：785-788.

[12]洪金妮，黎巍威，王學美.糖尿病腎病中足細胞損傷的信號通路及中藥的干預研究進展[J].中藥藥理與臨床，2017，33（3）：215-219.

[13]王念鴻，宮京梅，李英姿，等.貝那普利對早期糖尿病腎臟疾病足細胞損傷保護作用的實驗研究[J].中國糖尿病雜志，2017，25（10）：924-928.

[14]Yin Z，Pascual C，Klionsky DJ.Autophagy：machinery and regulation[J].Microb Cell，2016，3（12）：588-596.

[15]García-Prat L，Martínez-Vicente M，Perdiguero E，et al.Autophagy maintains stemness by preventing senescence[J].Nature，2016，529（7584）：37-42.

[16]石格，毛志敏，萬毅剛，等.糖尿病腎病足細胞損傷的病理機制及中藥的干預作用[J].中國中藥雜志，2016，41（13）：2416-2421.

[17]薛汝群，楊望，張敏，等.腎上腺髓質(zhì)肽在大鼠足細胞損傷模型中調(diào)控腎小球壁層上皮細胞分化[J].復旦學報：醫(yī)學版，2018，45（5）：611-619.

[18]饒春梅，成細華，任婷，等.加味丹參飲含藥血清對缺氧/復氧H9C2心肌細胞自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ及Beclin1表達的影響[J].中醫(yī)雜志，2017，58（12）：1043-1048.

[19]Büssing A，Vervecken W，Wagner M，et al.Expression of mitochondrial Apo2.7 molecules and caspase-3 activation in human lymphocytes treated with the ribosome-inhibiting mistletoe lectins and the cell membrane permeabilizing viscotoxins[J].Cytometry，1999，37（2）：133-139.

[20]Liu Z，Ding Y，Ye N，et al.Direct Activation of Bax Protein for Cancer Therapy[J].Med Res Rev，2016，36（2）：313-341.

[21]呂翠巖，張勝容，徐暾海，等.糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)JNK及Bax表達的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（6）：2643-2646.

[22]唐瓏，王悅芬，趙文景，等.保腎通絡方對早期糖尿病腎病大鼠尿蛋白及尿Nephrin、Podocin排泄的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2017，10（12）：1423-1427.

（2019-04-15收稿 責任編輯：芮莉莉）