凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死綜合癥病蝦與健康蝦腸道優勢菌群比較分析

蔣葛 沈輝 萬夕和 喬毅 黎慧 王李寶 史文軍

摘要：為研究急性肝胰腺壞死綜合征（Acute hepatopancreatic necrosis syndrome，AHPNs）病原對凡納濱對蝦腸道菌群的影響，獲取更多的AHPNs防治基礎資料，采用PcR-RFTJP方法比較了江蘇地區患AHPNs病蝦和健康對蝦腸道微生物群落。結果發現，不同生長階段病蝦腸道中均只有弧菌屬細菌;對照的健康對蝦中，幼蝦腸道優勢菌為假單胞菌屬、食酸菌屬和固氮螺菌屬細菌;養殖中期對蝦腸道優勢菌為發光桿菌屬、弧菌屬和希瓦氏菌屬細菌;養殖后期對蝦腸道優勢菌為弧菌屬、紅桿菌屬、萊茵海默氏菌屬細菌。研究結果表明，凡納濱對蝦患AHPNs后腸道微生物群落明顯不同于健康對蝦，腸道菌群多樣性遭到破壞，弧菌為腸道內絕對優勢細菌，不同生長階段健康對蝦的腸道優勢菌存在差異。本研究探究了AhPNs病原對于凡納濱對蝦腸道菌群的影響，并為認識和防控AHPNs提供試驗基礎。

關鍵詞：對蝦急性肝胰腺壞死綜合癥：凡納濱對蝦：腸道微生態

中圖分類號：s945.1 文獻標識碼：A 文章編號：1000-4440（2019）01-0142-07

急性肝胰腺壞死綜合征（Acute hepatopancreaticnecrosis syndrome，AHPNS）是近年來影響凡納濱對蝦養殖業的一種重要疾病。2009年該病在中國海南省發生，越南、馬來西亞、泰國、菲律賓相繼暴發該病。2011年以來，AHPNS在中國廣東、廣西、福建、江蘇等對蝦主產區蔓延，造成凡納濱對蝦產量銳減：泰國、越南、墨西哥等凡納濱對蝦主產國的對蝦產量也因該病的發生而受到嚴重影響。

凡納濱對蝦發生AHPNS后體色發白，蝦殼變軟，攝食明顯減少，活力減弱，行動遲緩。對蝦感染前期肝胰腺顏色暗淡蒼白或糜爛發紅，異常肥大：感染后期肝胰腺明顯萎縮，空腸空胃。苗種感染10d就可發病死亡，發病3 d內死亡率可達100%。有研究結果顯示，一類攜帶有特定致病基因PirA和PirB的弧菌屬細菌是該病發生的病原，其中主要是副溶血弧菌（vibrio parahaemolyticus）。病原弧菌含有的PiM和PirB基因會產生一種獨特的二元毒素，使靶細胞內外滲透壓改變，導致感染對象死亡。Pi-ra和PirB位于一段69 kb大小的隱藏質粒“pVAl”上，該質粒含有轉座子基因，能發生水平基因轉移，被認為是AHPNS近年來傳播較快的主要原因。目前，尚未見AHPNS有效治愈的報道。

腸道菌群在維持對蝦健康中發揮著重要作用，對對蝦的生長與免疫具有重要影響。對蝦腸道菌群不僅可以分泌蝦體所需的營養素，而且可通過競爭排斥抵抗病原微生物的侵襲，通過分析腸道菌群，可了解凡納濱對蝦的健康狀況。目前相關研究僅限于正常對蝦腸道菌群，且僅見于飼料添加劑、微生態制劑對腸道菌群的影響方面，關于特定病原對凡納濱對蝦腸道菌群結構的影響報道較少。本研究通過健康對蝦與AHPNS病蝦的腸道細菌群落比較，研究AHPNS病蝦的腸道菌群結構變化，可以從腸道微生態調控的角度為該病的防控提供基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗對蝦3份疑似AHPNS病蝦樣品（BSl～BS3）來源于江蘇省如東市3處出現大規模-對蝦暴死的養殖場，表現為肝胰腺萎縮，空腸空胃，瀕死癥狀。對照樣品來自相同養殖場同批正常對蝦（表1），樣品采集后冷藏，24h內帶回實驗室。每份樣品取6只對蝦個體，測量體長并計算均值：無菌操作分離對蝦腸道，清除內容物，取6只對蝦的腸道混合為一個樣品，滅菌生理鹽水沖洗內表面后置于離心管中，研磨成勻漿，80℃冷凍備用。

1.1.2主要試劑Taq DNA聚合酶、dNTPs、DLl00DNA marker、PMDl9-T克隆試劑盒和限制性內切酶為寶生物工程（大連）有限公司產品。DNA提取試劑盒（3S DNA Isolation Kit V2.2）、DNA膠回收試劑盒為上海博彩生物技術公司產品。

研究發現，AHPNS病蝦的腸道菌群結構單一，弧菌屬細菌為絕對優勢菌。有研究結果表明，白斑綜合征病毒（WhKe叩ot syndrome virus，WSSV）僅僅使得腸道菌群中各種屬細菌的數目和比例發生了改變，腸道菌群多樣性并未發生明顯變化，而AHPNS病原菌相較于WSSV，對于對蝦腸道菌群的影響更大，其造成腸道菌群結構崩潰，印證了AHPNS引發高死亡率的特點。PiWAB基因編碼的二元蛋白毒素可插入感染對象的細胞膜上形成穿模孔洞，導致細胞內外滲透壓的改變，使靶細胞損傷甚至死亡。本研究中病蝦腸道近乎透明，腸道細窄，韌性消失，無內容物。AHPNS病原菌的毒力極強，進入對蝦腸道后，分泌毒素，對蝦腸道細胞不斷壞死脫落，腸道細菌可能隨著壞死的腸黏膜和糞便一起排出體外，病蝦腸道菌群結構被完全破壞。腸道菌群對于對蝦的生長和抗病具有重要作用，堪稱是對蝦的另類“器官”，若腸道菌群結構被完全破壞，則對蝦的消化和抗病能力受到顯著影響。

蝦類腸道菌群結構與其所處的生長階段、生長環境以及健康狀況有關。吳金鳳等研究發現發病對蝦腸道菌群多樣性顯著降低，孫振麗等通過高通量測序研究發現凡納濱對蝦腸道菌群與池塘底泥及水體菌群關系密切。水生動物通過攝食將環境微生物和藻類攝入腸道，某些細菌被排出體外，部分細菌定殖于腸道。對蝦養殖水體以及自然水體中的主要優勢菌群為a-變形細菌綱和y-變形細菌綱細菌，凡納濱對蝦腸道菌群的主要優勢細菌類群為變形菌門和厚壁菌門細菌，主要包含弧菌屬、假單胞菌屬、發光桿菌屬等細菌。本研究中健康對蝦ZCl、ZC2樣品為20日齡和50日齡的對蝦群體，腸道菌群受水體菌群影響，優勢菌為弧菌屬、發光桿菌屬、紅桿菌屬細菌，歸屬于a-變形細菌綱和y-變形細菌綱。對蝦腸道菌群的組成是動態變化的，不同生長階段對蝦腸道菌群的組成也有較大的區別。蝦卵、糠蝦與幼蝦階段的蝦體內的優勢菌群為紅環菌科、柄桿菌目、伯克氏菌目、黃桿菌目、腸桿菌科、假單胞菌科細菌，弧菌屬細菌為劣勢菌。這與本研究的研究結果相近，ZC3樣品為幼蝦，腸道中優勢菌為假單胞菌屬、食酸菌屬、短波單胞菌屬和固氮螺菌屬細菌。在分類地位上，食酸菌屬歸屬于伯克氏菌目，固氮螺菌屬歸屬于紅環菌科，短波單胞菌屬則歸屬柄桿菌目。浮霉菌屬細菌是腸道優勢菌群，吳定心首次發現浮霉菌綱（Planctomycetacia）細菌為凡納濱對蝦腸道菌群優勢菌，并認為厭氧氨氧化細菌來自該綱，對氮循環起到一定作用。弧菌屬與發光桿菌屬是條件致病菌，當凡納濱對蝦受到氨氮等環境因子以及其他病原脅迫時，可能發生繼發性感染，發生多種病原毒力疊加。

本研究采用PCR-RFLP法研究了急性肝胰腺壞死綜合癥對凡納濱對蝦腸道菌群的影響，結果發現，健康凡納濱對蝦腸道優勢菌為弧菌屬、紅桿菌屬、萊茵海默氏菌屬、發光桿菌屬、弧菌屬等細菌，而凡納濱對蝦發生AHPNs后腸道菌群結構單一，腸道中弧菌屬細菌為絕對優勢細菌。