甘藍冷脅迫相關(guān)基因BobHLH18克隆與表達分析

秦文斌 戴忠良 山溪 唐君 王神云 李建斌

冷脅迫是影響作物生長、發(fā)育和產(chǎn)量的重要非生物脅迫因子之一。已有研究者指出，轉(zhuǎn)錄因子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵節(jié)點在植物應(yīng)答冷脅迫過程中起重要作用。轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)構(gòu)上通常具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄調(diào)控域及核定位信號區(qū)等功能域，其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域決定著轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合的特異性，使其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。bHLH轉(zhuǎn)錄因子作為一類重要的植物逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，因其在結(jié)構(gòu)上含有1個由10-15個氨基酸的氨基酸-基本區(qū)和40個氨基酸左右的α-螺旋環(huán)α-螺旋區(qū)（HIM區(qū)）構(gòu)成的50-60個氨基酸組成的bHLH保守結(jié)構(gòu)域而得名。其中，基本區(qū)域位于bHLH結(jié)構(gòu)域的N-端，具有DNA識別和結(jié)合順式元件的功能。近年來隨著多個植物基因組的測序完成，大量的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員已被鑒定，在擬南芥和水稻中bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族分別有超過140個和160個成員，而在煙草、二柄短麥草、白菜和番茄中則分別含有190、146、230和159個bHLH成員。

甘藍（Brassica oleracea var.capitata L.）是中國一種重要的蕓薹屬蔬菜，全國各地均有栽培。隨著近年來甘藍種植區(qū)的擴大，尤其露地越冬甘藍品種的大面積推廣，生產(chǎn)上對耐低溫的品種需求逐漸提高。而目前對甘藍耐寒材料篩選多依賴于田間自然低溫條件下的人工篩選，易受環(huán)境干擾，選擇效率不高，因而開展耐寒基因鑒定及利用與耐寒基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進行輔助選擇，是提高甘藍耐寒育種效率的重要手段。目前，在模式植物擬南芥上已有多個與耐寒性相關(guān)的基因被鑒定，如bHLH類的ICEl基因、AP2/DREB類的CBFl/CBF2/CBF3基因、COR基因、bZIP類RISBZ5、HOSl基因等。且已有研究結(jié)果表明，擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子具有廣泛的生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)種子萌發(fā)，表皮細胞形成，心皮發(fā)育，花藥發(fā)育，果實開裂，黃酮類及花青素生物合成及響應(yīng)光敏色素，激素信號，脅迫誘導(dǎo)等過程。

甘藍Y923為重組自交系，具有耐寒，抽薹遲等特性，目前該材料已進行了三代基因組測序，以其為研究對象鑒定耐寒相關(guān)基因，能為后續(xù)整合其基因組信息解析甘藍耐寒機制奠定前期基礎(chǔ)。為探討bHLH轉(zhuǎn)錄因子在甘藍耐寒方面的功能，本研究利用同源克隆方法，設(shè)計甘藍類bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因的特異擴增引物，結(jié)合RT-PCR技術(shù)在甘藍Y923冷處理全長cDNA文庫中，獲得一個受冷脅迫誘導(dǎo)表達的bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因，并根據(jù)其與擬南芥bHLH基因的同源性，將其命名為BobHLHl8。本研究對該基因在甘藍中的序列特征、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位及其在冷脅迫下的時空表達模式進行了分析，為進一步研究該基因功能提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

用于轉(zhuǎn)錄因子克隆的甘藍冷脅迫全長cDNA文庫由本實驗室構(gòu)建。基因序列克隆和冷脅迫處理所用的甘藍材料為結(jié)球甘藍（Brassica oleracea var.cap-itata）自交系Y923。選“四葉一心”期用1/2MS培養(yǎng)液在培養(yǎng)室水培7 d的甘藍幼苗，轉(zhuǎn)入4℃的低溫光照培養(yǎng)箱中進行冷脅迫處理，以培養(yǎng)室正常生長的植株為對照，分別在Oh、6 h、12 h、24 h和48 h時收集處理甘藍和對照植株的根、莖、葉，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 BobHLHl8基因全長序列的克隆

以T1和T2（表1）為引物，對篩選到的bHLHl8全長eDNA克隆進行雙向測序，通過DNAMAN軟件對序列進行拼接組裝，得到一致序列后提交NCBI進行ORF的預(yù)測。根據(jù)bHLHl8的eDNA序列設(shè)計引物，在甘藍gDNA中和eDNA中擴增bHLHl8基因，對PCR產(chǎn)物進行膠回收并克隆到pMDl8-T載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆進行測序驗證。

1.3 BobHLHl8基因染色體定位

通過搜索蕓薹屬基因組數(shù)據(jù)庫Brassica database（BRAD;http：//brassieadb.org/brad/）中與BobHLHl8基因序列完全相同的基因座序列及其基因組位置信息，對BobHLHl8進行電子定位及拷貝數(shù)分析。

1.4 BobHLHl8基因序列分析

利用DNAMAN和ORF Finder在線軟件進行核苷酸和氨基酸同源序列比對和開放閱讀框預(yù)測。利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）在線工具對bHLH進行保守域預(yù)測。用EXPASy在線工具Prot-Param（http：//www.expasy，org/tools/protparam.html）進行蛋白質(zhì)的分子量和等電點計算。用PSORT（http：//psort.ims.u-tokyo.ac.jp/）在線工具進行蛋白質(zhì)亞細胞定.位預(yù)測。同時，以BobHLHl8蛋白質(zhì)氨基酸序列作為母序列，在GenBank中搜索其他物種中與該基因同源的序列，并通過MEGA軟件進行進化分析。