藏羊肉中優勢腐敗不動桿菌的分離鑒定及其生物膜形成特性

史云嬌 劉芳 孫芝蘭 吳海虹 張新笑 諸永志 卞歡 朱云龍

摘要：本研究從冷鮮藏羊肉中共分離獲得40株腐敗菌，其中10株為不動桿菌，經結晶紫染色定量檢測發現10株不動桿菌均具有中等或強粘附成膜能力。對1株成膜能力最強的不動桿菌A3的成膜特性進行深入分析，發現該菌在培養3 d時生物膜內菌數最高，隨后培養5 d至7 d時菌數無顯著（P>0.05）變化。掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察及胞外多糖質量濃度測定結果表明，該菌形成生物膜的過程中培養1 d到3 d細菌迅速繁殖，培養3 d到5 d，菌體聚集成團，并且此時不可溶性多糖的含量最高，培養7 d時胞外分泌物質減少，生物膜出現解離狀態。因此，在藏羊肉加工過程中，針對此菌生物膜抑制的研究可著重關注控制胞外物質的分泌，并且在生物膜未成熟前實施消毒措施，有助于徹底殺滅生物膜內的腐敗菌。

關鍵詞：藏羊肉;不動桿菌;生物膜;胞外多糖

中圖分類號：s879.2 文獻標識碼：A 文章編號：1000-4440（2019）01-0195-09

藏羊（Tibetan sheep）又稱藏系羊，是分布于中國西藏、青海和甘南等青藏高原地區的主要畜種。藏羊肉具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇、肉質鮮嫩、少膻味的特點，故食用價值較高。目前國內外學者對藏羊肉的研究主要集中在營養成分及品質評價等方面，對其加工屠宰中的衛生安全問題研究較少。生物膜又稱生物被膜，是微生物抵抗外界不良環境的一種特殊生長方式，自然界中大多數微生物是以生物被膜的形式存在。在食品工廠中幾乎所有條件下，大多數致病菌或腐敗菌均可以粘附在不同接觸材料表面并形成生物被膜，從而對一些消毒劑的處理產生抗性作用，造成食品的交叉污染和周期性污染。在自然界大多數微生物也均可形成生物被膜，給人類公共衛生和食品安全帶來極大的威脅。因此，在食品加工過程中如何防止有害微生物形成生物被膜而引起食源性疾病是亟待解決的科學問題。

不動桿菌屬細菌（Acinetobacter spp.）是非發酵條件致病菌，是引起醫院內感染的致病菌之一。近年來，有大量文獻報道了不動桿菌屬是肉類食品中的腐敗菌之一。張秋勤在對生鮮雞中主要腐敗菌群的研究中發現貯藏前期與貯藏后期優勢菌均由不動桿菌、假單胞菌、肉桿菌、氣單胞菌和魏斯氏菌構成。Jul等對雞胴體表面分離的5 920株腐敗菌進行分析后發現30.5%為假單胞菌，22.7%為不動桿菌，13.9%為產黃菌（Flavobacterium spp.），12.7%為棒狀桿菌（Corynebacterium），20.2%為酵母菌等其他菌群。本研究擬對藏羊肉腐敗菌中不動桿菌的污染情況進行分析，并對其生物膜形成特性進行鑒定，然后以1株成膜能力較強的菌株為目標菌株，通過對其成膜后菌數、膜微觀結構、膜厚度及胞外分泌物中多糖含量的測定，研究該菌在7 d內的成膜特性，以期為今后藏羊肉加工過程中控制及殺滅該菌的研究提供參考。

2.4.1掃描電鏡觀察生物膜內菌體的微觀狀態掃描電子顯微鏡（sEM）作為研究細菌生物膜的儀器具有高分辨率、高放大倍數、成像清晰的優點，但生物膜在形成時，細菌細胞會嵌入胞外基質，形成厚層結構，SEM有時不能直觀地觀察到隱藏在基質內的細胞。通過掃描電鏡觀察不動桿菌生物膜在培養1 d、3 d、5 d、7 d時的微觀結構，結果如圖3，培養1 d，僅少量單層菌體粘附于孔板底部，此時尚無細菌聚集體形成，但已有少量菌體分泌胞外基質（圖4A）;培養3 d，菌體以多層堆疊的形式聚集在一起，且細菌聚集體已經形成，大量菌體被胞外基質包裹（圖4B）;培養5 d，菌體數量較第3 d無顯著變化，仍層疊為三維立體結構，但已有部分菌體暴露于胞外基質外（圖4c）;培養7 d，菌體明顯暴露于胞外基質外，且菌體呈損傷、不完整的狀態（圖4D）。

2.4.2激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜的厚度變化

由于SEM觀察生物膜中細菌細胞時受到胞外基質的影響，因此采用LIVE/DEAD BacLightTM試劑盒中的熒光染料對生物膜進行染色，進而通過轉盤式激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜內部包裹的細菌細胞分布狀況、生物膜形成的厚度，捕捉到不同培養時間下的圖像，獲得即時數據。試劑盒中含有2種熒光染料，每種均為熒光探針SYTO-9及碘化丙啶（PI）按照一定比例配制，SYTO-9與PT作為核酸染料染色后，未受損細胞呈現綠色熒光，受損及死亡細胞呈現黃色或紅色熒光。在7d的培養周期內不動桿菌生物膜經含有熒光探針的染料染色后可在激光共聚焦顯微鏡下呈現三維結構，培養1 d后可發現細菌粘附于接觸材料表面已明顯形成了生物膜的雛形結構，且生物膜中的活菌比例極高，但此時生物膜表面孔洞較多，厚度較薄（圖5A）;培養3d后大量的細菌粘附聚集體已經形成，且較為致密，表面平整光滑，同時，生物膜中已出現少量死菌，從CLSM中也可觀察出黃色菌體（受損菌）（圖5B）;培養5 d，接觸材料表面已經被細菌體覆蓋，但表面及側面較第3 d開始出現空隙及裂縫，膜厚度增加，但紅黃色熒光增多，此時，活菌比例呈現進一步顯著下降趨勢（圖5c）;培養7 d，生物膜表面及側面明顯出現較多孔洞，呈瓦解狀態，且膜的厚度較培養5 d減小，此時紅黃色熒光更多，說明菌體損傷死亡嚴重（圖5D）。

通過SEM、CLSM技術相結合，綜合兩方面獲得的信息可以解決SEM不能觀察到嵌入胞外基質中的細胞的問題[2引。SEM與CLSM結果相對應，培養3 d時，細菌迅速繁殖，且細胞聚集體相連，小聚集體減少，聚集體間空隙減少，膜表面逐漸光滑且比較致密;培養5 d后，細胞有損傷，紅黃熒光增多;培養7 d后，膜厚度明顯減少，表面出現大的空隙，且紅黃熒光進一步增多，說明細胞損傷死亡嚴重。

不動桿菌A3生物膜的形成速度較快，在1 d時已經可見有膜結構出現，在掃描電鏡及激光共聚焦顯微鏡觀察結果中，細菌成膜后細胞團之間成緊密的“網狀”三維立體結構，成膜性也較好。胞外多聚物（EPS）占生物膜干質量的90%以上，是微生物的自身代謝產物，被認為是構成生物膜骨架的重要物質。本試驗中測得研究的不動桿菌多糖質量濃度中可溶性多糖質量濃度高于不可溶性多糖質量濃度，而在劉紅艷等在對饑餓狀態下糞腸球菌產多糖能力的研究中發現細菌生物膜中水溶性多糖僅作為生長所需底物被利用，而不可溶性多糖則介導細菌對介質表面的粘附和細菌間的共聚。生物膜在形成過程中起主要作用的組分有多糖、蛋白及胞外DNA，胞外多糖是形成成熟生物膜必不可少的成分，因此，試驗中通過對胞外多糖含量的變化表示EPS變化，但組成EPS成分的結構變化還需借助傅里葉紅外光譜或拉曼光譜。等儀器測定。

3討論

目前，已有大量研究發現，細菌生物膜的形成是一個動態過程，從細菌的定殖、粘附、聚集到分化成熟直至播散，共經歷5個階段。細菌在粘附48 h后能形成初期的生物膜，在72 h后則逐步變為成熟生物膜。本試驗中通過對目標菌株不動桿菌A31 d、3 d、5 d、7 d的培養，監測其生物膜內菌數、膜微觀結構、膜厚度及胞外分泌物中多糖含量發現該菌在第3 d時生物膜內菌數可達到最大值，隨后培養5d到7 d菌數無顯著變化：對其微觀結構觀察發現，培養1 d時細菌從單層結構逐漸聚集成細胞集團，細胞集團繼續聚集形成較大細胞團簇，彼此之間逐漸相連，縫隙及孔洞減少，形成密集結構，膜的厚度增加，在培養3 d時達到最大，7 d時膜厚度減小，部分菌體呈不完整狀態。研究結果符合細菌生物膜生長的一般規律。

研究者發現胞外多糖普遍存在于各種環境下形成的生物膜中，而對于不能合成胞外多糖的突變體只能形成短暫的小菌落，難以形成成熟穩定的生物膜。sutherland研究混合菌生物膜結構發現，只要存在能合成胞外多糖的微生物，就能形成成熟穩定的生物膜，且該生物膜結構中還包含大量不能合成胞外多糖的微生物菌株。綜上可知，胞外多糖是大多數細菌形成成熟生物膜結構不可或缺的組成部分。本研究發現，不動桿菌A3生物膜在形成過程中，成膜速度較快，胞外分泌物質會在培養3 d時達到最多，將細菌緊緊包裹，7 d時胞外分泌物減少，菌體明顯暴露于胞外基質外，生物膜有解離趨勢。因此，針對此菌生物膜抑制的研究中可著重關注控制胞外物質的分泌，具體如何控制胞外物質分泌以及抑制生物膜的形成還需后期進一步研究。