原花色素對釀酒酵母cAMP-PKA信號轉導途徑的影響

祝凱麗，商文倩，史明珠，張慧，李靜媛

(青島農業大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266109)

氧化脅迫是葡萄酒發酵過程中經常面臨的脅迫之一[1]。釀酒酵母在面臨H2O2脅迫時會表現出菌體生長受到抑制和細胞相應的防御基因會發生變化[2]。cAMP-PKA信號轉導是細胞胞外信號分子與受體相結合，從而引起胞內cAMP的水平變動而調解酵母細胞代謝、增殖、分化、壓力抗性等。cAMP是細胞內參與調節物質代謝和生物學功能的重要物質，它廣泛參與機體內的各種生理活動，是生物體內重要的第二信使[3]。PKA是釀酒酵母中蛋白激酶A，其活性與海藻糖含量之間具有密切相關性[4]。海藻糖是一種非還原性的二糖，由葡萄糖以α，α-1，1糖苷鍵連接而成，廣泛存在于各種生物體內，在高溫、高滲透壓、酒精、氧化等逆境環境中能夠保護微生物細胞質膜的完整性和蛋白質的穩定性[5-7]。本實驗以原花色素為切入點，將原花色素與cAMP-PKA信號轉導途徑相聯系，通過考察酵母在氧化脅迫中內源性海藻糖的積累情況及胞內海藻糖的逆境合成信號傳遞系統，分析酵母逆境防御應答機制及原花色素在此機制中起到的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 酵母菌株

SaccharomycescerevisiaeAWRI R2由Marivin(Australian)公司商業化，具有良好的發酵性能。

1.1.2 主要試劑

原花色素、cAMP標準品(純度為97.71%)，購于北京索萊寶科技有限公司；海藻糖標準品，購于北京萬佳首化生物科技有限公司；RNA提取試劑盒，購于天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒(GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Mix，gDNA remover selected)，購于北京擎科新業生物技術有限公司。

1.1.3 培養基

YPD液體培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10。

模擬葡萄汁(model synthetic meddium，MSM)培養基：由陳琳等首先使用，模擬標準葡萄汁中確定的化學成分，該培養基模擬釀酒酵母的發酵環境，適于研究葡萄酒釀造酵母的生物發酵特性[8]。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵體系

將培養體系分別置于確定的氧化脅迫條件下。外加一定濃度的原花色素，設定對照，發酵體系如表1所示。

表1 不同發酵體系濃度梯度Table 1 Concentration gradient of different fermentation systems

1.2.2 發酵實驗

在進行發酵前將酵母菌AWRI R2接種到YPD培養基中，28 ℃，150 r/min，12～14 h富集酵母菌。二次活化接種到50%培養基中富集12～14 h后，接種到培養基中，28℃靜置培養。定時稱重確定最終取樣時間。

1.2.3 酵母細胞破碎

離心收集細胞，用冰冷的 0.1 mol/L的咪唑鹽酸緩沖液(含 1 mmol/L DTT， pH=7.4)沖洗2次。250 mg(濕重)菌體與 0.5 mL上述緩沖液混合，0 ℃超聲破碎(80 個循環，每循環破碎 3 s，停 3 s)， 4 ℃離心取上清液用于酶活、cAMP等的測定。

1.2.4 酵母細胞內cAMP含量

參照蘇豫梅等[9]的方法。色譜條件：色譜柱為HydersirBDSC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、流動相為V(0.1mol/L KH2PO4)∶V(甲醇)=85∶15、流速為1.0 mL/min、柱溫35℃、進樣量5 μL、檢測波長254 nm,定量方法：采用外標法按峰面積進行定量。

cAMP標準曲線的繪制：稱取適量cAMP標準品，加去離子水溶解后設置不同濃度梯度的cAMP標準品，分別為1、4、8、10、20 mg/L，過0.45μm濾膜，在前述的色譜條件下進行分析，記錄色譜峰面積，以cAMP含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.5 酵母菌海藻糖含量測定

按LIU等[10]的方法，海藻糖的檢測使用高效液相色譜儀(Waters 2695， Milford， MA， USA)，色譜柱為Aminex HPX-87H (300mm×7.8mm) (Bio-Rad, USA)。柱溫65℃,流動相為 0.005 mol/L H2SO4，流速為 0.600 mL/min。檢測器選擇示差檢測器,進樣量為 5 μL。

海藻糖標準曲線的繪制：稱取適量海藻糖標準品，設置不同的濃度梯度，分別為1、4、8、10、20 mg/L的標樣，過0.45μm濾膜，在前述的色譜條件下進行檢測分析，記錄色譜峰面積，以海藻糖含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.6 環腺苷酸環化酶酶活測定

參照侯曉月等[11]的試驗方法，把Na2ATP作為反應底物，反應1 min后所產生cAMP的含量(μg/mL)。然后參照蘇豫梅等[9]的方法測cAMP含量。

腺苷酸環化酶的測定方法：向含有沉淀的EP管里加入80 μL 30℃預熱的31 mmol/L Na2ATP溶液和31 mmol/L MnCl2溶液，再加入30℃預熱的840 μL 0.31 mol/L MES緩沖液，將加入反應混合物的EP管于30℃保溫10 min。終止酶活反應采用煮沸法，沸水浴煮沸1min后，讓酶失活。冷卻、離心、過濾，用液相色譜法測定濾液中的cAMP含量。3次重復實驗。

一個單位酶活(Unit)的定義為：在上述實驗條件下，每min產生1 μmol cAMP所需要的酶量定義為一個酶活單位。

1.2.7 熒光定量PCR分析

1.2.7.1 酵母RNA的提取及反轉錄

采用天根生化科技有限公司RNA提取試劑盒進行RNA提取并進行反轉錄。

總RNA的提取；

(1)50～100 mg菌體在液氮中迅速研磨成粉末，加入450 μL RL，旋渦振蕩混勻，56 ℃孵育3 min。

(2)所有溶液轉移至過濾柱CS上(過濾柱CS放在收集管中)，12 000 r/min離心5 min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的離心管中。

(3)緩慢加入0.5倍上清體積的無水乙醇(通常為225 μL)，混勻(此時可能出現沉淀)，將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱CR3中，1 200r/min離心30～60 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。

(4)向吸附柱CR3中加入350 μL去蛋白RW1，12 000 r/min離心30～60 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。

(5)DNase I工作液的配制：取10 μL DNase I儲存液放入新的RNase-Free離心管中，加入70 μL RDD溶液，輕柔混勻。

(6)向吸附柱CR3中央加入80 μL的DNase I工作液，室溫放置15 min。

(7)向吸附柱CR3中加入350 μL去蛋白液RW1，12 000 r/min離心30～60 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。

(8)向吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液RW，室溫靜置2min,12 000 r/min離心30～60 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。

(9)重復步驟8

(10)12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液，將吸附柱CR3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

(11)將吸附柱CR3放入一個新的RNase-Free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30～100 μL RNase-Free ddH2O，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min，得到RNA溶液。-80℃保存RNA樣本。

反轉錄：

(1)將RNA模板，RNase-Free water，10 x gDNA remover buffer置于冰上融解備用。

(2)在無核酸酶的微量離心管中按表2配制反轉錄反應體系(10 μL)：

表2 反轉錄反應體系Table 2 Reverse transcription reaction system

注：用槍頭輕輕混勻，短暫離心后，42℃孵育2min，隨后60℃孵育5min。

(3)混合物迅速置于冰上冷卻，短暫離心后加入表3所示組分：

表3 熒光定量體系Table 3 Fluorescence quantitative system

(4)用槍頭輕輕混勻，短暫離心后，50℃孵育15min，85℃孵育5min，置于冰上或冷藏備用。

1.2.7.2 引物設計

引物設計如表4所示。

表4 Real-time PCR所需的引物Table 4 Primers required for real-time PCR

注：據報道酵母的Actin基因在發酵過程中的表達量沒有變化，被作為參照。其他基因的表達量需要與此基因相比得到。

1.2.7.3 熒光定量PCR程序

熒光定量PCR程序采用20 μL體系，程序為： 95 ℃預變性1 min， 95 ℃變性10 s，55 ℃ 退火10 s，72 ℃延伸10 s，40個循環；95 ℃延伸15 s，60 ℃延伸15 s。

樣品送往青島擎科梓熙生物技術有限公司進行檢測。

2 結果與分析

2.1 酵母菌生長曲線

圖1中酵母菌的生長速度呈現明顯的差別，添加H2O2的體系中酵母菌的增長速度最慢，而添加了H2O2后再加入原花色素的體系酵母菌的生長速度遠遠超過只添加原花色素的體系，甚至超過了空白組。由此可見，H2O2營造的氧化脅迫條件抑制了酵母菌的繁殖與增長，而在氧化脅迫條件下加入原花色素可以促進酵母菌的繁殖與增長。為研究添加原花色素后培養體系中的變化，將從海藻糖含量以及關鍵代謝通路等指標進行驗證。

圖1 酵母菌的生長曲線Fig.1 Yeast growth curve

2.2 胞內海藻糖含量

海藻糖作為應激代謝的產物，在不同的脅迫條件下會保護生物大分子[12-14]。由圖2可知不同發酵體系中酵母胞內海藻糖含量差異非常明顯。添加H2O2的體系中胞內海藻糖最低，而添加H2O2后加入原花色素后胞內海藻糖的含量明顯升高，且高于空白組，這說明原花色素可以刺激酵母在氧化脅迫條件下產生海藻糖抵抗逆境。

圖2 不同發酵體系中酵母胞內海藻糖含量Fig.2 Intracellular trehalose content of yeast in different fermentation systems

然而原花色素作為大分子物質，無法進入細胞，不能直接作為信號因子調控細胞的代謝活動來應對發酵環境中的多種脅迫因子[15]。原花色素是如何作用于酵母，引起海藻糖含量變化起到保護酵母的作用？cAMP-PKA信號轉導是細胞胞外信號分子與受體相結合，從而引起胞內cAMP的水平變動而調解酵母細胞的各種代謝活動的一種途徑[3]。有研究表明， PKA可調節從細胞生長到對營養、滲透壓和壓力的應激反應過程，PKA活性與海藻糖含量之間具有密切相關性[16-17]。因此為探究海藻糖變化原因，我們將從關鍵信號轉導途徑等方面進行驗證。

2.3 cAMP及關鍵基因和酶測定

由圖3～圖6可知,不同處理的酵母菌細胞中,CYR1和Actin基因的熔解曲線均呈現單一峰,說明基因片段特異性良好,可以用于進行后續的檢測。同時根據循環數曲線,設定基因CYR1閾值為558.6。

圖3 酵母胞內cAMP的含量Fig.3 Intracellular cAMP content in yeast

圖4 不同發酵體系的腺苷酸環化酶酶活Fig.4 Adenylate cyclase enzyme activity in different fermentation systems

圖5 CYR1和Actin基因特異性片段熔點的Real-Time PCR分析Fig.5 Agarose gel electrophoretic analysis of the specific fragment smelting point of Actin and CYR1

圖6 基因CYR1的標準曲線Fig.6 Standard curve of gene CYR1

基因CYR1的標準曲線均呈現良好的線性關系,相關系數為0.998,說明此標準曲線可用。標準曲線為Y=-4.094X+6.156。其中Y為達到閾值所需要循環數的lg值；X為初始模板。

實時定量PCR有絕對定量和相對定量之分,絕對定量通過標準曲線得到起始模板的精確拷貝數,相對定量又分為相對標準曲線法和比較CT法(2-△△CT法),通過內參照的標定可分析基因在樣本中的表達差異。本研究應用2-△△CT法處理數據。數據如圖7所示。

圖7 不同發酵體系中酵母CYR1基因的相對表達量Fig.7 Relative expression levels of yeast CYR1 gene in different fermentation systems

體系B中酵母菌cAMP含量最低。體系C中cAMP的含量最高，甚至遠遠超過了空白組的含量。腺苷酸環化酶和CYR1基因呈現相同的趨勢，即在添加H2O2的體系中酶活和相對表達量最低，在添加H2O2后添加原花色素的體系中最高，且高于空白組，這說明原花色素是從基因水平改變了基因的表達量，最終影響了cAMP生成量。

2.4 PKA關鍵基因分析

由圖8可知,不同發酵體系中的酵母細胞中BCY1和Actin基因的熔解曲線都呈現出單一峰,說明該基因片段特異性較好,可以繼續進行后續檢測。同時根據循環數曲線,設定基因BCY1閾值為940.6。

由圖9可知,編碼基因BCY1的標準曲線呈現良好的線性關系,相關系數為0.991。說明此標準曲線可用。

標準曲線為Y=-2.925X+11.85,其中Y為達到閾值所需要循環數的lg值；X為初始模板。

不同發酵體系中酵母菌BCY1基因的相對表達量如圖10所示。體系C中BCY1基因較體系A有所升高，體系B較體系A有所降低，這說明原花色素可以緩解H2O2對BCY1基因的抑制作用，并對其基因的表達起到促進作用。有研究表明，BCY1是PKA調節亞基的編碼基因，當細胞內環腺苷酸cAMP含量升高時，cAMP會與PKA調節的亞基BCY1相結合，釋放出催化亞基從而激活PKA，BCY1基因的表達量會影響PKA的活性[4]。結合圖3所示，BCY1基因的相對表達量與cAMP都升高，這可能會提高PKA的含量。而PKA含量的提高可能會導致海藻糖含量的提高，這與圖2所示結果一致。

圖8 BCY1和Actin基因特異性片段熔點的Real-Time PCR分析Fig.8 Real-Time PCR analysis of specific melting points of BCY1 and Actin genes

圖9 基因BCY1的標準曲線Fig.9 Standard curve of gene BCY1

圖10 不同發酵體系中酵母BCY1基因的相對表達量Fig.10 Relative expression levels of yeast BCR1 gene in different fermentation systems

3 討論

生物體氧化還原狀態對于細胞適應外界環境起到重要的指示作用[18-19]。研究表明多種信號分子作用于膜受體后，可通過G蛋白激活腺苷酸環化酶，產生第二信使cAMP。cAMP作為第二信使，進一步激活PKA、Epac及下游的調控元件，從而調節細胞內活動[20]。本文中cAMP-PKA做為胞外信號轉導途徑，其關鍵基因CYR1的相對表達量升高使得其編碼腺苷酸環化酶酶活提高，從而使得cAMP含量升高，激活PKA。而PKA的活性與海藻糖產量存在密切關系，PKA的增多促使酵母產生海藻糖抵抗外界環境變化。

王建發等研究證明芍藥苷通過cAMP-PKA信號通路發揮對心肌梗死大鼠的保護作用,且治療作用呈劑量相關性[21]。張莘莘等研究黑靈芝多糖能夠引起胞內cAMP濃度升高、PKA活性增強，從而激活小鼠結腸癌細胞內cAMP-PKA信號[22]。研究證明柴胡皂苷A降低IL-1β的致熱作用可通過降低下丘腦cAMP的分泌和PKA的活性，抑制胞漿信號轉導通路PKA系統實現[23]。三七葉總皂苷能逆轉抑郁大鼠行為學癥狀以及調節海馬體cAMP、PKA、BDNF的水平。三七葉總皂苷具有良好的抗抑郁作用，其作用機制與調控海馬體cAMP、PKA、BDNF水平有關[24]。綜合前人研究，cAMP-PKA途徑的調控作用廣泛存在于生物體中，對調節各方面機能起著重要的作用，而本文也正是依托海藻糖的變化對cAMP-PKA途徑進行了研究，CYR1作為調控cAMP的關鍵基因，CYR1的升高與cAMP的酶活呈現相同變化趨勢，這說明在氧化脅迫下加入原花色素可以從基因水平改變表達量，從而使得腺苷酸環化酶酶活升高，增加了cAMP的生成量；cAMP的變化導致PKA含量的增加，最終使得海藻糖增加，以保護酵母抵抗逆境。