一株具α-糖苷酶抑制活性、抗氧化和抗細菌活性的香椿內生真菌的篩選與鑒定

王曉敏,萬景瑞,史冠瑩,張樂,蔣鵬飛,程菁菁,王趙改

(河南省農業科學院,農副產品加工研究中心，河南 鄭州, 450000)

香椿是我國特有的集材、菜、藥為一體的珍貴木本植物，具有抗逆性強、不易發生病蟲害的特點[1]。據文獻記載，香椿含有多酚、黃酮、生物堿、皂苷、萜類等多種活性物質[2-3]，具有重要的生物活性，如降血糖[4-5]、抗氧化[6-7]和抗菌活性[8-9]等。

內生真菌是一類生活在宿主植物組織中，并對其組織不引起明顯病癥的微生物。根據共生理論，內生真菌可以產生與宿主植物相同或相似的生物活性物質[10-11]，且具有生長速度快、發酵周期短、易于工業化等特點[12]，因此，植物內生真菌已成為尋找和發現各種天然生物活性物質的新資源。

α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類治療Ⅱ型糖尿病的口服降糖藥，主要通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性，降低餐后高血糖[13-14]。因此，α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發對糖尿病患者控制餐后血糖水平具有重要意義。活性氧是細胞代謝中所產生的自由基，會導致蛋白質、脂肪、DNA等生物大分子的氧化損傷，而長期處于氧化損傷狀態會導致諸如心血管疾病、慢性炎癥等慢性疾病[15]。因此，抗氧化劑的研究對治療心血管疾病、延緩機體衰老也具有重要意義。隨著抗菌藥物的廣泛應用和濫用，耐藥菌株不斷增加，抗感染治療陷入耐藥菌危機之中。為了應對耐藥菌感染，人們不斷研究和開發新型抗菌藥物。而香椿內生真菌作為一種天然活性物質資源庫，對開發具有降糖、抗氧化和抗菌活性的活性物質具有重要的研究意義。

因此，本研究首次以河南香椿植物為材料，進行內生真菌的分離純化，并以α-葡萄糖苷酶抑制活性、抗氧化活性和抗細菌活性為指標，篩選出高活性菌株。然后通過rDNA序列分析，在NCBI上進行序列比對和構建系統發育樹，并結合傳統的形態學觀察進行菌株的分類鑒定。這為后期香椿內生真菌的開發利用提供了理論參考，為從香椿內生真菌中獲得結構新穎、生物活性多樣高效的次生代謝產物提供了研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紅油香椿，采自河南省鄭州市中牟縣田莊村河南省農業科學院香椿示范基地；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒及PCR相關試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司；α-葡萄糖苷酶、對硝基苯基葡萄糖苷，美國Sigma公司；阿卡波糖，拜耳醫藥保健有限公司；2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、鏈霉素，北京索萊寶生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，東京化成工業株式會社；其他分析純試劑，鄭州博越商貿股份有限公司。

1.1.2 儀器與設備

YXQ-LS-75SII-01-00立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司；SJ-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；GHP-9160恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；恒溫培養搖床，上海一恒科技有限公司；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；R-1001型旋轉蒸發儀，鄭州長城科工貿有限公司；XHF-D高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；GENESYS 10S UV-VIS紫外-可見分光光度計，美國Thermo公司；XSP-BM8A型生物顯微鏡，上海光學儀器廠；2720 thermal cycler PCR儀，Applied Biosystems；DYCP-31DN電泳儀，北京六一儀器廠；FR980凝膠成像儀，上海復日科技儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 內生真菌的分離純化[16]

表面消毒：用流水將香椿莖表面浮土沖洗干凈，然后用無菌水漂洗2次，風干表面水分，轉移至超凈工作臺，在無菌條件下，將香椿莖用體積分數為70%乙醇浸泡1 min，次氯酸鈉溶液(有效氯30 g/L)浸泡1min，70%乙醇浸泡30 s，無菌水漂洗3次，無菌吸水紙吸干表面備用。

菌株的分離、純化：表面消毒好的香椿莖，無菌條件下，用滅菌剪刀剪成0.5 cm左右的小塊放在馬鈴薯固體培養基(PDA)上，每板3～5根，于28℃恒溫培養箱培養3 d。當植物組織內部向培養基周圍長出菌絲時，將內生真菌轉移到新的PDA平板培養基上對其劃線培養，3～5 d后分離純化得到單菌落，然后轉移到PDA斜面上，4℃冰箱保存，編號備用。其中，PDA固體培養基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，瓊脂20。

1.2.2 次級代謝產物的制備

發酵：將4℃冰箱保藏的香椿內生真菌接種到PDA固體培養基平板上，28℃培養箱活化培養4 d，然后接種到盛有200 mL液體發酵培養基的錐形三角瓶中，28 ℃ 150 r/min搖床發酵培養7 d。其中，PDA液體發酵培養基(g/L)：土豆200，葡萄糖10，麥芽糖20，甘露醇20，蛋白胨5，酵母膏3，味精5，pH 6.0。

提取：菌株發酵完成后，發酵培養液先用勻漿攪拌機攪碎，再用布氏漏斗抽濾，得到發酵液和菌絲體。然后分別采用等量乙酸乙酯對發酵液和菌絲體進行萃取，重復3次，合并得到乙酸乙酯提取液。

濃縮：將乙酸乙酯提取液用旋轉蒸發儀于40 ℃減壓濃縮蒸干，即得到菌株的次級代謝產物浸膏。

樣品液配制：將濃縮后的發酵浸膏用無水乙醇溶解配制成10 g/L的溶液。備用待測。

1.2.3 體外活性評價

1.2.3.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性[17]

在620 μL 0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)中，加入5 μL α-葡萄糖苷酶溶液與10 μL待測樣品液，37.5 ℃預熱20 min，加入10 μL對硝基苯基葡萄糖苷(pNPG，10 mmol/L)作為反應底物以啟動反應，37.5 ℃下反應30 min。然后加入650 μL 1 mol/L Na2CO3終止反應，在 410 nm處測定酶活。同時以相同濃度的阿卡波糖溶液為對照，平行測定3次。樣品液用量如表1所示。

表1 反應條件 單位：μL

計算公式(1)如下：

(1)

式中：A空白為未知樣品液的改光度值;A樣品為樣品與酶反應后的吸光度值；A背景為樣品空白吸光度值。

1.2.3.2 抗氧化活性

(1)ABTS+·清除活性[18-19]

參照OZCAN[18]提出的用H2O2/ABTS/醋酸鹽緩沖液體系來生成ABTS+·，這種方法產生的ABTS+·十分穩定。具體方法如下：

將0.549 g ABTS+·溶解在100 mL的2 mmol/L H2O2醋酸鈉鹽溶液中(最終濃度10 mmol/L)，室溫放置1 h，有特征的藍綠色ABTS+·產生。然后將10 mmol/L 的ABTS+·用醋酸鈉鹽緩沖液(pH 3.6)稀釋到734 nm下吸光度(0.70±0.02)。取150 μL無水乙醇溶解的樣品溶液，加入3 mL ABTS+·溶液，準確振蕩30 s，測定反應液在734 nm下的吸光度值。同時以相同濃度的Vc溶液為對照，平行測定3次。ABTS+·清除率計算如公式(2)：

(2)

式中：A0為未加樣的ABTS+·的吸光度值；At為樣品與ABTS+·反應后的吸光度值；B為樣品空白的吸光度值。

(2)DPPH·清除活性[20]

準確稱取0.019 7 g DPPH，用無水乙醇定容至250 mL，配成2×10-4mol/L的DPPH溶液。取樣品液和2×10-4mol/L DPPH溶液各2 mL分別加入試管中，搖勻，室溫下避光放置30 min，使其充分反應。以無水乙醇為參比在517 nm波長處比色，測定其吸光度Ai；同時測定2 mL無水乙醇與2 mL DPPH溶液的混合液的吸光度Ac和2 mL樣品溶液與2 mL無水乙醇的吸光度Aj。同時以相同濃度的Vc溶液為對照，平行測定3次。計算DPPH·清除率見公式(3)：

(3)

1.2.3.3 抗細菌活性[21]

病原細菌：歐文氏菌(Erwiniasp.) (ATCC 02203)、茄科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum) (ATCC 01474)、水稻白葉枯(Xanthomonasoryzae) (ATCC 11602)、豪氏變形桿菌(Proteushauseri) (ATCC 10497)、銅綠假單孢菌(Pseudomonasaeruginosa) (ATCC 10500)、大腸桿菌(Escherichiacoli) (ATCC 25922)、金黃色葡萄糖球菌Staphylococcusaureus(ATCC 25923)。

測試細菌接種于液體培養基中，培養12 h。

將培養基在121 ℃下高壓滅菌30 min，冷卻至約40～50 ℃后，在凈化工作臺上將無菌培養基倒入90 mm 無菌培養皿中，培養基凝固后，吸取200 μL菌懸液置于培養皿中央，用涂布棒涂布均勻，然后用滅菌鑷子在培養皿中放入無菌牛津杯(直徑Φ=6 mm)，在其中加入200 μL供試樣液(平行3次)，同時作溶劑和陽性對照實驗。平板于30 ℃培養12 h后觀察并測定抑菌圈的直徑(mm)。其中，陽性對照為相同濃度的鏈霉素溶液，陰性對照為無水乙醇溶劑。

其中，液體培養基：

營養肉汁培養基(g/L)：蛋白胨10，牛肉提取物3，NaCl 5，pH 7.0。

胰化酪蛋白胨大豆肉汁培養基(g/L)：胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)30。

溶菌肉湯(LB)培養基(g/L)：酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.0。

固體培養基：

營養肉汁瓊脂培養基(g/L)：蛋白胨10，牛肉提取物3，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.0。

胰化酪蛋白胨大豆肉汁瓊脂培養基(g/L)：TSB 30，瓊脂20。

LB瓊脂培養基(g/L)：酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂20，pH 7.0。

1.2.4 菌株鑒定

1.2.4.1 菌株的形態學鑒定

將待鑒定的內生真菌接種到PDA固體培養基上，28 ℃連續培養4～5 d，觀察菌落形態特征。挑取菌落邊緣菌絲，制作水浸片，在光學顯微鏡下觀察菌絲體的形態特征。

1.2.4.2 菌株的分子生物學鑒定[22]

(1)DNA提取：從保藏菌種的斜面培養基中挑取菌絲轉接到PDA平板上，28 ℃培養4～5 d。基因組DNA的提取采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(SK8259)，嚴格按照說明書操作。提取的基因組DNA在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(150 V，100 mA、20 min)。4 ℃保存備用，或于-20 ℃中長期保存。

(2)PCR擴增18S序列

18S rDNA擴增引物：NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)/NS6(5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′)，PCR反應條件為預變性94 ℃、4 min，變性94 ℃、45 s，退火55 ℃、45 s，延伸72 ℃、1 min， 共30個循環，最后修復延伸72 ℃、10 min。

PCR擴增采用25 μL的反應體系，包括ddH2O 19.8 μL，PCR緩沖液(10×, Mg+plus) 2.5 μL，dNTP(各2.5 mmol/L) 1 μL，引物-F(10 μmol/L) 0.5 μL，引物-R(10μmol/L) 0.5 μL，DNA 0.5 μL，Taq 聚合酶 0.2 μL。

(3) PCR擴增產物的電泳檢測：產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后4℃保存備用。

(4) PCR產物純化和測序：由生工生物工程(上海)股份有限公司進行。

1.3 數據統計與分析[23-24]

采用DPS軟件對數據進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，用Tukey多重比較法檢驗差異顯著性，5%為顯著水平。

系統進化樹的構建：將所測得的序列在NCBI中進行Blast比對，下載與供試菌株序列同源性相近的菌株序列，利用ClustalX軟件進行序列的多重比對，利用MEGA7.0軟件N-J方法(neighbor-joining)構建系統發育樹，自展數為1 000。

2 結果與分析

2.1 香椿內生真菌的活性篩選

香椿經分離、純化，共分離得到6株內生真菌。將分離得到的內生真菌進行液體發酵培養，制備得到其次級代謝產物，然后對其進行α-葡萄糖苷酶抑制活性、抗氧化和抗細菌活性的測定，結果見表2～表4。

注：同列小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同。

由實驗結果表明，在10 g/L的樣品質量濃度下，6株香椿內生真菌的次級代謝產物均具有一定程度的抑制α-葡萄糖苷酶活性。其中，菌株56-50抑制活性最高，為(24.98±1.89)%，高于對照品(19.64±1.00)%，但兩者無顯著差異(P>0.05)，與菌株TS47的α-葡萄糖苷酶抑制活性差異顯著(P<0.05)。

由實驗結果，可以看出,在10 g/L的樣品質量濃度下，菌株56-50和TS47均具有較好的抗氧化活性。其中，菌株56-50對ABTS+·的清除活性為(95.92±0.40)%，與對照品Vc無顯著差異(P>0.05)，與其他樣品差異顯著(P<0.05)。菌株56-50和TS47對DPPH·的清除活性分別為(91.77±0.45)%和(94.55±0.15)%，均與對照品Vc無顯著差異(P>0.05)，與其他樣品差異顯著(P<0.05)。

注：抗菌活性以菌圈直徑(mm)計；“-”表示未檢出活性。

抑菌圈的大小表示抑菌活性高低。其中抑菌圈越大，表示抑菌活性越高，反之，抑菌活性越低。由表4可看出，陰性對照乙醇沒有抑菌圈，說明沒有抑菌活性，從而排除溶劑影響。在10 g/L的質量濃度下，陽性對照鏈霉素抑菌效果明顯。菌株TS8對軟腐病歐文氏菌具有較強的抑制活性，與陽性對照無顯著差異(P>0.05)。菌株56-50對豪氏變形桿菌具有較強抑制活性，與陽性對照無顯著差異(P>0.05)。

內生真菌與植物的長期協同進化，可能導致了內生真菌與宿主植物有基因交流，致使內生真菌與宿主植物有相同或相似的代謝途徑，因而可能會產生與宿主植物相同或相似的活性次級代謝產物[25]。這為在植物內生真菌中尋找與其宿主相同或相似的活性化合物提供理論基礎。據文獻報道，香椿能產生降糖、抗氧化或抗菌的活性物質，其內生真菌也可能會產生此類或者相似的生物活性物質。因此，香椿植物內生真菌是一類亟待開發的微生物資源，在食品、生物制藥、農業生產等領域具有潛在的應用價值。

本研究對香椿植物內生真菌進行了活性測試，結果表明菌株56-50的次級代謝產物具有較好的α-糖苷酶抑制活性、抗氧化活性以及抗細菌活性，提示該菌株可能產生具有降糖、抗氧化和抗菌作用的活性物質。因此，選擇菌株56-50對后續開發天然α-糖苷酶抑制劑、抗氧化劑和抗菌劑具有潛在的研究價值。

2.2 菌株56-50的鑒定

2.2.1 形態學特征

菌落形態特征：菌株56-50在PDA平板培養基上培養1 d，可產生零星的放射狀白色菌絲，4 d后菌落直徑為6.0 cm，絨毛狀或棉絮狀，具明顯的同心輪紋，中央為墨綠色，外部淡黃色至灰綠色，菌落平坦，表面具少量稀疏的白色氣生菌絲(圖1-a)，8 d后菌落布滿培養皿。

孢子形態特征：分生孢子頂生，暗褐色，近卵形；分生孢子梗單生，深褐色，具明顯的橫隔(圖1-b、圖1-c)。

a-在PDA培養基上28 ℃培養4 d后的菌落正面形態；b～c-菌絲、分生孢子及分生孢子梗(×100)圖1 內生真菌56-60的菌落特征Fig.1 Morphological characteristics of the endophytic fungus 56-60

2.2.2 分子生物學鑒定

由于形態學特征無法準確判定菌株56-50的種屬地位，因此采用分子生物學方法對其進行鑒定：以提取出的菌株56-50的DNA為模板，對其18S rDNA基因片段進行PCR擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，擴增產物為1 300 bp左右的特異性擴增條帶，大小與期望值相符。PCR擴增產物由上海生工有限公司進行測序，測序結果表明，該菌株的18S rDNA基因序列長度為1 322bp。菌株56-50交由中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏(保藏號：CGMCC No.12980)。

將PCR擴增獲得的18S rDNA序列在NCBI中進行BLAST分析，結果表明，菌株56-50的18S rDNA序列與鏈格孢屬Alternariasp.的18S序列同源性最高，相似性達100%。利用ClastalX與Mega 5.0軟件，基于18S rDNA序列構建系統發育樹，見圖2，從系統進化樹上可以看出，每一個屬分別形成一個獨立的分枝，菌株56-50與Alternariasp.(KT192438.1)和Alternariasp.(GQ253348.1)處于同一分枝，親緣關系最近，判斷該菌株為鏈格孢屬Alternariasp.。

圖2 基于18S rDNA基因序列構建的鄰接樹Fig.2 Neighbor-joining tree based on 18S rDNA gene sequences

3 討論與結論

1993年，STIERLE等[26]首次從短葉紅豆杉中分離得到1株能產生抗癌物質紫杉醇的內生真菌，表明內生真菌具有合成和宿主植物相同或相似活性物質的能力，從而使植物內生真菌成為尋找和發現各種天然生物活性物質的新資源。周生亮等[27]研究了4株薯蕷(Dioscoreazingiberensis)內生真菌的發酵液和菌絲的抗氧化活性，發現這4株菌株的菌絲和發酵液具有不同的抗氧化活性。劉軍生等[28]從七葉樹Aesculuschinensis根和莖中分離得到1株內生真菌EA-LJS80，發現其發酵產物具有較強的抑菌活性，這為挖掘對人體有益的活性物質提供了理論基礎。

真菌傳統的主要分類依據是形態結構、生化特征等，但由于真菌種類繁多，形態復雜，因此，在傳統真菌分類中常引起誤鑒或錯鑒。隨著分子生物學、遺傳學等學科的快速發展，在真菌現代分類學中引入了分子生物學技術的鑒定方法，通過提取真菌DNA基因組進行測序分析，確定菌株的屬種地位，使真菌分類研究變得簡便快捷、準確可靠。

本文首次以河南紅油香椿為研究材料，從其體內分離純化出6株內生真菌，并以α-葡萄糖苷酶抑制活性、抗氧化和抗細菌活性為靶標，篩選出1株具有最好生物活性的菌株56-50。然后采用分子生物學和形態學特征相結合的方法對其進行鑒定，根據18S rDNA基因測序結果在NCBI上進行同源性比對，并通過MEGA 5.0序列分析軟件構建系統進化樹，根據進化樹結果，結合培養特征，將菌株56-50鑒定為鏈格孢屬Alternariasp.。

香椿植物本身具有重要的降糖、抗氧化和抗細菌等生理活性，而在本實驗中，從香椿中分離出來的Alternariasp.也表現出較好的α-糖苷酶抑制能力、抗氧化能力以及抗細菌能力，這顯示出內生真菌與宿主在功能上的一致性，將為進一步豐富該真菌的功能多樣性提供了證據，也為從香椿內生真菌中尋找新的天然α-糖苷酶抑制劑、抗氧化劑和抗菌劑提供了可能。今后，將進一步對該菌進行大量發酵，通過采用分離純化技術，進一步研究其中的單體化合物結構，為深入揭示內生真菌和宿主香椿之間的關系以及挖掘天然α-糖苷酶抑制劑、抗氧化劑和抗菌劑提供理論依據。