納豆芽孢桿菌產(chǎn)納豆激酶發(fā)酵工藝控制及纖溶酶分析

葛蕓，湯斌，李松

(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖，241000)

目前，常見治療心血管疾病的靜脈溶栓藥物有鏈激酶(streptokinase，SK)、尿激酶(urokinase，UK)和組織纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen aetivator，t-PA)等[1]，然而，這些溶栓藥物在靜脈中保持藥效時間短，存在出血性并發(fā)癥等風險[1-2]。納豆激酶(nattokinase，NK)是由日本科學家SUMI等在傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆中發(fā)現(xiàn)的一種具有溶解血栓功能的絲氨酸蛋白酶[3-4]。與上述常見的溶栓劑相比，納豆激酶不僅可以直接水解交聯(lián)狀態(tài)的纖維蛋白，還能刺激血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生t-PA，將人體內(nèi)的尿激酶原激活為尿激酶，進一步促進血栓溶解[5-6]，具有活性高、安全性高、成本低、口服方便等優(yōu)點，存在巨大的應(yīng)用潛力[7-8]。納豆激酶的生產(chǎn)方式主要有固態(tài)發(fā)酵法[9]和液態(tài)發(fā)酵法[10]，如張杰等[11]利用固態(tài)發(fā)酵法獲得納豆激酶的產(chǎn)量為4 087.83 U/g；KWON等[12]在5 L發(fā)酵罐中采用pH-stat補料的方式獲得納豆激酶的產(chǎn)量為14 500 U/mL，是目前文獻報道的最高發(fā)酵水平。董艷山等[13]利用枯草芽孢桿菌在7 L發(fā)酵罐通過分批發(fā)酵的方式獲得最高發(fā)酵水平是6 717 U/mL。與固態(tài)發(fā)酵相比，液態(tài)發(fā)酵更適合于納豆激酶的發(fā)酵過程控制和放大生產(chǎn)。因此，研究納豆激酶的液態(tài)發(fā)酵控制工藝對提高納豆激酶的表達量及其產(chǎn)品試制具有重要的研究意義。

納豆激酶活性的檢測主要利用纖維蛋白平板法，也是國家衛(wèi)生部認定為尿激酶和蚓激酶等纖溶酶活性測定的標準方法[14]，其原理是通過纖溶酶降解凝血酶激活纖維蛋白原形成的纖維蛋白而產(chǎn)生透明圈，并以尿激酶標準品為基準計算得到相應(yīng)的纖溶酶活力[15]。目前，納豆激酶主要生產(chǎn)菌為納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)，為枯草芽孢桿菌的一個亞種，而枯草芽孢桿菌所產(chǎn)纖溶酶除了納豆激酶外，可能還含有其他纖溶酶，例如與納豆激酶蛋白質(zhì)序列相似度高達97.63%、但在理化性質(zhì)上卻存在較大差異的纖溶酶BSF1[16]。因此，在利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶時，上述具有納豆激酶相似活性纖溶酶的存在，可能會對納豆激酶活性的精確測定帶來較大的影響。為此，本文在利用放大發(fā)酵工藝控制提高納豆激酶表達量的同時，構(gòu)建了納豆激酶基因突變菌株，通過反向驗證法分析了納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中纖溶酶組分，為納豆激酶活力測定的準確性和真實性提供了有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌種

納豆芽孢桿菌TN-02由本實驗室篩選保藏。

1.1.2 主要試劑

牛血纖維蛋白原(100 mg/支)、凝血酶(1 000 U/瓶),購于Sigma公司；尿激酶(1 240 IU/瓶),購于國家藥品標準物質(zhì)網(wǎng)；TaqDNA聚合酶、T4連接酶和質(zhì)粒pMD19-T(Simple),購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；卡那霉素,購于上海生工生物工程股份有限公司；豆粕,購于蕪湖市農(nóng)貿(mào)市場；復配豆制品消泡劑,購于江蘇常州市食品添加劑有限公司；其他試劑,均為國藥集團化學試劑有限公司分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，NaCl 10，酵母粉5。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，NaCl 10，酵母粉5，甘油5。

放大發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：甘油30，豆粕粉12.5，Na2HPO4·12H2O 4，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.6，CaCl20.1，蛋氨酸0.2，色氨酸0.1，苯丙氨酸0.1， 酪氨酸0.1。

1.1.4 儀器與設(shè)備

TC312 PCR儀，美國TECH公司；BIOTECH-10JSA 10 L全自動發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；QHZ-123B組合式搖床，江蘇省太倉市華美生化儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備

用接種環(huán)從固體培養(yǎng)物中挑取1環(huán)納豆芽孢桿菌TN-02接種于含有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于37 ℃、200 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)12 h， 制得一級種子液。取1 mL一級種子液接種于含有300 mL種子培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)14 h，制得二級種子液。

1.2.2 10 L發(fā)酵罐放大發(fā)酵控制

依據(jù)搖瓶發(fā)酵優(yōu)化所得培養(yǎng)基組成作為發(fā)酵罐放大基礎(chǔ)培養(yǎng)基(見1.1.3)。將上述二級種子液(OD600=3.9)按接種量5%接種于10 L發(fā)酵罐中，裝液量6 L。發(fā)酵初始條件：通氣量1.5 vvm，罐內(nèi)壓力0.05 MPa，轉(zhuǎn)速300 r/mim，利用氨水(質(zhì)量分數(shù)25%)調(diào)節(jié)pH值為7.0。發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通氣量和罐壓將發(fā)酵液溶氧濃度(DO)控制在30%左右，同時依據(jù)發(fā)酵進程調(diào)整溫度和補料控制條件。

溫度對納豆芽孢桿菌TN-02發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響：分別將發(fā)酵罐內(nèi)溫度控制在30、33、35和37 ℃進行分批發(fā)酵，以研究培養(yǎng)溫度對納豆激酶表達水平的影響。

流加甘油對納豆芽孢桿菌TN-02發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響：在發(fā)酵過程中，通過流加甘油(質(zhì)量濃度100 g/L)使其終濃度維持在15 g/L左右，研究甘油補料發(fā)酵對納豆芽孢桿菌TN-02發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響。

流加胰蛋白胨對納豆芽孢桿菌TN-02發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的影響：由于發(fā)酵液中胰蛋白胨無法精確測定，在發(fā)酵過程中分別以0.3、0.5、0.7、1.0 g/(h·L)的速度流加胰蛋白胨，確定發(fā)酵時流加胰蛋白胨對納豆激酶表達量的影響。

1.2.3 納豆激酶活力測定的方法

根據(jù)ASTRUP等[17]方法制作纖維蛋白平板，將尿激酶標準品進行梯度稀釋，每種濃度吸取10 μL點樣于纖維蛋白平板上，于37 ℃恒溫箱中保溫18 h。測定不同透明圈的垂直直徑，以垂直直徑乘積(A)的對數(shù)值為縱坐標，以尿激酶標準品濃度(C)的對數(shù)值為橫坐標繪制尿激酶標準曲線(線性回歸方程為：lnA=0.365lnC+4.158 9，R2=0.996 4)。

納豆芽孢桿菌TN-02發(fā)酵液于8 000 r/min條件下離心2 min，將上清液稀釋一定倍數(shù)后，取10 μL點于纖維蛋白平板上，37 ℃培養(yǎng)箱中保溫18 h，測量透明圈的垂直直徑，并根據(jù)尿激酶標準曲線計算納豆激酶活力。

1.2.4 甘油的測定方法

甘油濃度測定采用滴定法[18]進行。

1.2.5 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank已報道的納豆激酶基因序列進行納豆芽孢桿菌TN-02納豆激酶基因aprN引物設(shè)計，根據(jù)質(zhì)粒pPIC9K中所含卡那霉素抗性基因kan的序列信息設(shè)計引物。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，具體序列見表1。

表1 本文中所用引物Table 1 Primers used in this study

注：劃線部分為酶切位點。

1.2.6 納豆激酶基因缺失重組菌的構(gòu)建

納豆芽孢桿菌TN-02中納豆激酶基因失活采用同源重組的方法[19-20]。以納豆芽孢桿菌TN-02基因組DNA為模板，利用引物NK-F和NK-R擴增得到aprN序列，其大小為1 473 bp，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與質(zhì)粒pMD19T相連接，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pMD19T-aprN。測序結(jié)果表明，在aprN序列的第403位和第1 160位堿基處分別有NotⅠ和NcoⅠ的單酶切位點。因此，研究中通過將kan序列替換重組質(zhì)粒pMD19T-aprN中NotⅠ和NcoⅠ位點之間的aprN序列(749 bp)，從而構(gòu)建得到含有以aprN上游序列(410 bp)為上同源臂，kan基因序列(816bp)和aprN下游序列(314bp)為下同源臂的重組質(zhì)粒PMD19T-aprNΔkan，其構(gòu)建過程如圖1所示。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化[21]進入納豆芽孢桿菌TN-02中，利用重組質(zhì)粒攜帶的aprN序列兩端同源臂進行同源重組，并使用含有15 μg/mL卡那霉素平板篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子。以陽性轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，利用引物NK-F和NK-R進行PCR擴增并對PCR產(chǎn)物進行測序，以驗證aprN△kan序列是否與原始aprN序列產(chǎn)生了正確的同源交換和重組。

圖1 重組質(zhì)粒pMD19T-aprN△kan的構(gòu)建Fig.1 Cloning strategy of recombinant plasmids pMD19T-aprN△kan

1.2.7 重組菌的生長及纖溶酶活性的測定

將重組菌和原始菌分別接種于20 mL (50 mL三角瓶)LB培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min條件下活化12 h。取100 μL活化種子液接種于100 mL(250 mL三角瓶)LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)，期間每隔2 h取樣1次測定菌體濃度，繪制生長曲線。同時，取1 mL上述活化種子液接種于50 mL(250 mL三角瓶)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵產(chǎn)物中纖溶酶活力，并進行SDS-PAGE 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對納豆激酶發(fā)酵活力的影響

當溫度控制在30～35 ℃時，雖然培養(yǎng)溫度越高，所獲得的菌體生長速度越快且達到最大酶活所需時間越短，但是菌體的迅速生長導致產(chǎn)生大量泡沫，不利于發(fā)酵控制和產(chǎn)酶期的穩(wěn)定。例如，將控制溫度進一步提升至37 ℃時，產(chǎn)酶水平及酶的穩(wěn)定性開始下降(圖2-a)。實驗中，分別嘗試了聚醚類，有機硅類和高碳醇脂肪酸酯類等多種消泡劑對泡沫進行控制，均無法達到理想的消泡效果。因此研究中進一步采用了變溫發(fā)酵方式，以期獲得細胞生長和泡沫產(chǎn)生之間的平衡。具體變溫控制工藝為：在0～12 h采用30 ℃ 培養(yǎng)菌體，降低菌體生長速率(控制泡沫產(chǎn)生)，在12 h后將溫度分別調(diào)整至為33、35和37 ℃，以獲得菌體在短時間內(nèi)的快速生長和產(chǎn)物生成。結(jié)果表明，當后期溫度調(diào)整為35 ℃時，總發(fā)酵時間達到18 h時納豆激酶活力最大，為9 865.7 U/mL，比 35 ℃恒溫發(fā)酵提高了18.5%，如圖2-b所示。

a-恒溫發(fā)酵;b-變溫發(fā)酵圖2 發(fā)酵溫度對納豆芽孢桿菌TN-02產(chǎn)納豆激酶的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the production of nattokinase by Bacillus natto TN-02

2.2 甘油補料發(fā)酵

采用上述變溫發(fā)酵控制工藝，在發(fā)酵至第12 h，將發(fā)酵溫度調(diào)整為35 ℃并開始流加甘油，使甘油終質(zhì)量濃度維持在15 g/L左右。結(jié)果顯示，通過流加甘油工藝獲得的平均產(chǎn)酶水平明顯高于對照組，產(chǎn)酶時間亦得到了延長(2 h)，最終在第20 h，納豆激酶發(fā)酵活力達到最高，為12 285.6 U/mL，相比對照組所得最高活力提高了23.2%，如圖3所示。

2.3 胰蛋白胨補料發(fā)酵

在甘油補料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，當發(fā)酵溫度調(diào)整為35 ℃ 時，開始分別以0.3、0.5、0.7、1.0 g/(h·L)的速度補加胰蛋白胨。結(jié)果表明，胰蛋白胨流加速度為0.5 g/(h·L)時，納豆激酶的表達量明顯高于其他流加速度下的表達量，在第20 h獲得的納豆激酶酶活峰值為13 978.3 U/mL，比單一甘油補料發(fā)酵提高了13.7%，如圖4所示。

圖3 流加甘油對納豆芽孢桿菌TN-02產(chǎn)納豆激酶的影響Fig.3 Effect of feeding glycerol on the production of nattokinase by Bacillus natto TN-02

圖4 流加胰蛋白胨對納豆芽孢桿菌TN-02產(chǎn)納豆激酶活力的影響Fig.4 Effect of feeding tryptone on the production of nattokinase by Bacillus natto TN-02

2.4 納豆激酶基因缺失重組菌的構(gòu)建

測序結(jié)果表明納豆芽孢桿菌TN-02中aprN序列與NAKMURA等[22]已報道的序列(GI：262 756)相似性為100%。利用引物NK-F和NK-R從陽性轉(zhuǎn)化子基因組DNA擴增得到的目的基因片段與設(shè)計的突變盒大小(1 540 bp)一致，比原始菌株aprN基因片段大67 bp，如圖5所示。

M-DNA Marker；1-突變盒片段；2-納豆激酶基因片段圖5 突變盒與納豆激酶基因的克隆Fig.5 Cloning of inactivated gene and nattokinase gene

進一步對重組菌中的突變盒進行序列測定，結(jié)果與設(shè)計的基因序列一致，表明突變盒已成功插入到納豆芽孢桿菌TN-02的基因組中并與待突變基因aprN發(fā)生了同源交換。

2.5 納豆激酶基因缺失對重組菌生長的影響

在搖瓶培養(yǎng)至第6 h，納豆芽孢桿菌TN-02和重組菌TN-021均開始進入對數(shù)生長期。可能受到aprN敲除的影響，重組菌TN-021在對數(shù)生長期生長趨勢慢于原始菌，比原始菌延遲2 h進入生長穩(wěn)定期。到達生長穩(wěn)定期時，重組菌和原始菌的最大OD值均在4.1左右，如圖6所示，說明敲除aprN對納豆芽孢桿菌TN-02生長繁殖無顯著(P=0.764>0.05)影響。

圖6 重組菌與原始菌生長曲線Fig.6 Comparison of the cell culture between the recombinant strain TN-021 and the Bacillus natto TN-02

2.6 重組菌纖溶酶活的測定

在相同搖瓶培養(yǎng)條件下，重組菌TN-021發(fā)酵產(chǎn)物在纖維蛋白平板上未檢測到纖溶酶活力，與之相比，原始菌纖溶酶活力為7 748.7 U/mL，如圖7-a所示。發(fā)酵上清經(jīng)蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析(圖7-b)后，重組菌TN-021發(fā)酵產(chǎn)物在28 kDa處未檢測到納豆激酶條帶，表明aprN的缺失阻斷了納豆激酶的合成，證明了納豆激酶是納豆芽孢桿菌TN-02發(fā)酵產(chǎn)物中唯一纖溶酶。

a-重組菌與原始菌纖溶酶活測定;b- SDS-PAGE分析圖7 重組菌與原始菌發(fā)酵產(chǎn)物中纖溶酶檢測Fig.7 Detection of plasmin in fermentation products of the recombinant strain TN-021 and Bacillus natto TN-02注：a圖：1-100 IU/mL尿激酶標樣； 2-原始菌(稀釋80倍)； 3-重組菌。b圖：M-Maker； 1-原始菌； 2-重組菌；3-純化后的納豆激酶。

3 結(jié)論

基于搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果，在10 L發(fā)酵罐上進行了納豆芽孢桿菌TN-02產(chǎn)納豆激酶放大工藝的研究。采用溫度階段性控制的方式，0～12 h控制溫度為30 ℃，降低菌體生長速率，12 h后采用35 ℃進行發(fā)酵，提高產(chǎn)酶水平，解決了發(fā)酵過程中菌體生長和泡沫產(chǎn)生的矛盾，提高了納豆激酶的發(fā)酵活力。通過流加甘油和胰蛋白胨的補料分批發(fā)酵工藝，獲得納豆激酶的最高表達量為13 978.3 U/mL，是搖瓶發(fā)酵最高表達量的1.8倍。同時，通過構(gòu)建納豆激酶基因缺失重組菌TN-021，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后其發(fā)酵產(chǎn)物中未檢測到纖溶酶活力。證明了納豆激酶是納豆芽孢桿菌TN-02發(fā)酵產(chǎn)物中唯一纖溶蛋白酶，為準確測定納豆激酶活力提供了有力依據(jù)。