蜂膠、蜂蠟復合涂膜劑對雙孢蘑菇的保鮮作用

劉小霞，安學明，贠建民，李彥虎，牛耀星，趙風云

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)

雙孢蘑菇(Agaricusbisporus,A.bisporus)是目前世界上人工栽培最廣泛、產量最高、消費量最大的食用菌，也是我國目前最大宗的出口創匯食用菌，具有重要的經濟價值[1]。其味道鮮美、營養豐富，且具有一定的醫療保健的作用[2]。雙孢蘑菇質地細嫩，表面沒有顯著的組織保護，保質期很短，是一種極易腐爛的食用菌[3-4]。目前，各國對雙孢蘑菇的保鮮研究已經比較深入，包括低溫冷藏、氣調保鮮、輻照保鮮、化學涂膜劑等，冷藏及氣調保鮮效果好，但成本高[5-8]。涂膜保鮮法操作簡單，成本低廉，可有效延長食用菌貯藏期[9]。相對于單一涂膜劑，復合涂膜劑保鮮效果更好。復合涂膜劑一般由成膜基質輔以抑菌材料和助膜材料等組成[10]，其優勢在于可有效保障涂膜劑的穩定性，加強抑菌、抗氧化等多方面的性能[11]，是一種既經濟方便又安全有效的保鮮方法。

蜂膠是西方蜜蜂(Apismellifera)采集植物樹脂，并混入蜂蠟、花粉及蜜蜂腺體分泌物后經蜜蜂咀嚼加工而成的一種黏稠物質[12]。蜜蜂利用蜂膠防止巢房內異物腐爛和病菌的傳染[13]。郭東起等[14]利用不同濃度的蜂膠粗提液保鮮冬棗，發現可顯著降低病原微生物侵染概率，進而降低冬棗貯藏中的腐爛指數，使冬棗保持較好的品質。CANDIR等[13]的研究表明，蜂膠提取液在4周內能有效防止櫻桃的真菌腐敗。蜂蠟是蜜蜂腹部蠟腺分泌出來的一種蠟質混合物[15]，具有可食用性、超疏水性和延展性，能在材料表面形成一層薄膜，具有成本低、經濟實用等性能[16]。肖錫湘[17]利用蜂蠟保鮮劑保鮮南豐蜜桔，發現其不同程度地抑制了果實的呼吸強度，減少了營養物質的損耗，抑制水分蒸發，延長了蜜桔貯藏期。蜂膠、蜂蠟在果蔬保鮮方面單獨應用較多，對混合保鮮的研究鮮有報道。

本文利用不同濃度的蜂膠溶液和蜂蠟溶液制作復合涂膜劑，利用響應面法對復合涂膜劑的配方進行優化后，對雙孢蘑菇進行保鮮處理。通過測定貯藏期間雙孢蘑菇的感官評分、褐變度、失重率、硬度、呼吸強度、可溶性蛋白、SOD、POD、CAT、PPO、MDA含量，腐爛指數及菌落總數等指標考察其保鮮效果，以期篩選出一種新型可食性蜂膠蜂蠟復合涂膜劑的配方，為雙孢蘑菇的保鮮提供一種新方法，也為將蜂膠蜂蠟應用于其他果蔬保鮮提供一定的理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗與材料

蜂膠：采自云南西雙版納植物園試驗蜂場。

蜂蠟：于云南西雙版納植物園試驗蜂場采集意蜂舊巢脾1 kg，采用蒸汽加熱法進行制蠟[18]。

雙孢蘑菇：采自于甘肅平涼金沃森科技有限公司靈臺蘑菇基地，挑選新鮮、大小均勻、無明顯機械損傷和褐變的蘑菇。

1.2 試劑與儀器

吐溫80，重慶川東化工(集團)有限公司；NaOH，天津市大茂化學試劑廠；考馬斯亮藍G-250，重慶川東化工集團有限公司；75%乙醇，無錫市亞泰聯合化工有限公司；硫代巴比妥酸，南京化學試劑有限股份公司。

FA1004B型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；TCL-16型離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；UV-2450PC紫外可見分光光度計，日本島津公司；HWS低溫恒溫恒濕箱，寧波東南儀器有限公司；722S可見光分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗

蜂膠溶液：參考曹紅剛等[19]方法，獲得蜂膠溶液，用蒸餾水稀釋成體積分數為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%溶液備用。

蜂蠟溶液：稱50 g蜂蠟于燒杯中，加熱融化，同時攪拌至形成穩定的澄清油相，加入90 ℃的水制成體積分數為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的蜂蠟溶液，冷卻待用。

吐溫80：吸取吐溫80 20 mL，蒸餾水稀釋成體積分數為1%、1.5%、2%、2.5%和3%溶液，待用。

保鮮方法：將預冷的雙孢蘑菇單獨浸泡于不同濃度的75%蜂膠溶液、蜂蠟溶液及吐溫80涂膜劑中2 min， 冷風吹干后，用聚乙烯塑料筐盛放，每筐約500 g。在塑料筐外面套上保鮮袋后，迅速扎緊袋口，于4 ℃下貯藏，用蒸餾水作CK，以雙孢蘑菇貯藏期的褐變度變化來考察涂膜劑的效果。

1.3.2 響應面試驗設計

根據單因素試驗優化結果，利用Design-Expert軟件設計3因素3水平的響應面試驗，如表1所示。

表1 雙孢蘑菇響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test of A.bisporus

在響應面試驗的基礎上，以蒸餾水處理作為CK，測定腐爛指數、失重率、硬度、呼吸強度、可溶性蛋白、SOD、POD、CAT、PPO、MDA含量、菌落總數，以考察優化后的復合涂膜劑組合對雙孢蘑菇的保鮮效果。

1.3.3 試驗指標測定方法

褐變度測定：參照ZENG等[20]方法測定。測定取8 g雙孢蘑菇，加1.6 g PVP于20 mL 0.2 mol/L pH 6.8的檸檬酸-磷酸緩沖液中，冰浴研磨，8 000×g離心10 min，取上清，于波長450 nm處測定吸光度值，用此值表示褐變程度。

失重率：采用稱重法；硬度：硬度計測定；呼吸強度：采用靜置法；可溶性蛋白：參照考馬斯亮藍測定法[21]； POD、CAT、SOD、PPO活性：參照曹健康等[21]方法測定；MDA：參照李合生[22]方法測定；菌落總數測定：參照GB4789.2—2016[23]測定；感官評價：參照李彥虎等[24]略作修改，選擇食品專業的9人經專業培訓，對雙孢蘑菇的色澤、組織形態、滋氣味等感官指標進行評價，評分低于60分表示不能被消費者接受，評價標準詳見表2；腐爛指數的測定：參照楊燕婷等[25]方法，按公式(1)計算，腐爛指數等級劃分如表3所示。

表2 感官評價評分表Table 2 Sensory Evaluation Scale

表3 腐爛指數等級劃分表Table 3 Rating index ranking table

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1.4 數據分析

以上試驗均重復3次，采用Excel 2010繪圖；響應面優化采用Design-Expert 8.0.6軟件進行二次回歸分析及方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

雙孢蘑菇采摘后，極易發生褐變。褐變不僅影響外觀品質，還會降低雙孢蘑菇的營養和食用價值[3,26]，本研究以褐變度為檢測指標進行單因素試驗。

研究表明，第1～15天，不同體積分數的蜂膠溶液、蜂蠟溶液和吐溫80均可降低雙孢蘑菇的褐變度，蜂膠溶液體積分數為1.5%時，蜂蠟溶液、吐溫80的體積分數均為2%時，雙孢蘑菇褐變度最低。第15天的褐變度隨蜂膠溶液的濃度變化如圖1-A所示，當蜂膠溶液為1.5%時，雙孢蘑菇褐變度最低為0.75。第15天的褐變度隨蜂蠟溶液及吐溫80的濃度變化如圖1-B所示，當蜂蠟溶液、吐溫80為2%時，雙孢蘑菇褐變度均最低，分別為為0.72、0.83。

圖1 不同體積分數的蜂膠溶液、蜂蠟溶液和吐溫80對雙孢蘑菇褐變度的影響Fig.1 Effect of udume fraction of propolis solution, bees wax solution and Tween 80 on browning degree of A.bisporus

2.2 Box-Behnken中心組合設計試驗結果

在單因素試驗基礎上，以蜂膠溶液、蜂蠟溶液、吐溫80三個因素對雙孢蘑菇貯藏期褐變度的影響，采用3因素3水平的響應面分析法。按照表4中的Box-Behnken試驗方案進行試驗，各組褐變度見表4。

表4 復合涂膜劑試驗設計及結果Table 4 Test design and results of composite coating agent

復合涂膜劑二次回歸方程：褐變度=0.28+0.014×X1-0.018×X2-8.875E-003×X3+

表5 復合涂膜劑試驗二次回歸方程模型方差分析Table 5 Variance analysis of quadratic regression equation model for composite coating agent test

注：**P<0.01，差異極顯著；*P<0.05，差異顯著。

由圖2可知，蜂蠟溶液對復合涂膜劑配方影響極顯著(P<0.01)，而蜂膠溶液對復合涂膜劑配方影響顯著(P<0.05)，吐溫80對復合涂膜劑影響不顯著(P>0.05)。

圖2 復合涂膜劑配方的響應面立體分析圖Fig.2 A three-dimensional analysis of the response surface of the composite coating agent formulation

蜂蠟溶液與吐溫80之間的交互作用顯著(P<0.05)， 蜂膠溶液與吐溫80交互作用極顯著(P<0.01)，F值越大影響越顯著，響應面的梯度曲線曲面彎曲程度大，表示影響越顯著。各因素對水解度的影響順序為X2

綜合單因素及響應面試驗結果，雙孢蘑菇復合涂膜劑優化工藝參數為:蜂膠溶液1.39%，蜂蠟溶液2.04%， 吐溫80 2.01%，褐變度預測值為0.28，驗證(n=6)后試驗值為0.29，相對誤差0.01，試驗值基本與預測值相符。

2.3 雙孢蘑菇的復合涂膜劑保鮮試驗

2.3.1 復合涂膜劑對雙孢蘑菇感官評價的影響

利用蜂膠、蜂蠟復合涂膜劑保鮮雙孢蘑菇，并進行感官評價(圖3)。結果發現，隨著貯藏時間的延長，雙孢蘑菇感官評分均呈下降趨勢，對照與處理之間差異顯著(P<0.05)。對照組在第15天時感官評分下降至57分(表6)，子實體出現開傘、褐變現象，但經復合涂膜劑處理后的子實體在第15天時感官評分值仍為68.89分，相比于CK，處理組的感官評分提高了20.86%，且子實體感官品質維持良好。

圖3 復合涂膜劑處理對雙孢蘑菇感官品質的影響Fig.3 Influence of compound coating agent on sensory quality of A. bisporus注：圖片描述第1行均為CK，第2行為處理組，其余下同。

表6 復合涂膜劑處理前后的雙孢蘑菇感官評分對比Table 6 Comparison of sensory scores of A.bisporus before and after treatment with compound coating agent

2.3.2 復合涂膜劑對雙孢蘑菇失重率、硬度的影響

由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，CK和處理組的失重率均呈上升趨勢，硬度則均呈下降趨勢。處理組的失重率均顯著低于CK，而硬度均顯著高于CK(P<0.05)。第15天時，CK、處理組失重率分別為16.00%、12.00%，硬度分別為4.00、6.45 MPa，相比于處理組，CK失重率增加了4.00%，硬度降低了37.98%。本試驗中，雙孢蘑菇的失重率與硬度呈負相關關系，復合涂膜劑處理可延緩雙孢蘑菇的失重率升高及硬度的下降。

圖4 復合涂膜劑對雙孢蘑菇失重率與硬度的影響Fig.4 Effect of composite coating agent on weight loss rate and hardness of A.bisporus

2.3.3 復合涂膜劑對雙孢蘑菇呼吸強度的影響

由圖5可知，CK和處理組的呼吸強度均呈先升后降的變化趨勢。處理組與CK均在第3 d達到呼吸高峰，呼吸高峰值分別為101.00和107.78 mg/(kg·h)，處理組的呼吸高峰值比CK降低了6.29%。第3天后，處理組呼吸強度均顯著低于CK(P<0.05)。復合涂膜劑降低了貯藏期間雙孢蘑菇的呼吸強度。

圖5 復合涂膜劑對雙孢蘑菇呼吸強度的影響Fig.5 Effect of composite coating agent on respiratory intensity of A. bisporus

2.3.4 復合涂膜劑對雙孢蘑菇可溶性蛋白含量的影響

由圖6可知，隨著貯藏時間的延長，CK和處理組的可溶性蛋白含量均呈下降趨勢。第6天后，處理組可溶性蛋白含量均顯著高于CK(P<0.05)。第15天時，處理組的可溶性蛋白含量(3.94 mg/g)比CK(3.27 mg/g)高20.49%。復合涂膜劑可有效抑制貯藏期雙孢蘑菇可溶性蛋白含量的降低。

圖6 復合涂膜劑對雙孢蘑菇可溶性蛋白含量的影響Fig.6 Effect of composite coating agent on soluble protein content of A. bisporus

2.3.5 復合涂膜劑對雙孢蘑菇MDA含量的影響

由圖7可知，隨著貯藏時間的延長，CK和處理組的MDA含量均呈上升趨勢。第6天后，處理組MDA含量均顯著低于CK(P<0.05)。第15天時，處理組的MDA含量(1.24 mmoL/g)低于CK(1.45 mmoL/g)14.48%。 結果表明，復合保鮮劑能夠有效抑制雙孢蘑菇在貯藏過程中的細胞膜脂的過氧化，減少了MDA的積累，可對細胞膜結構有一定保護作用。

圖7 復合涂膜劑對雙孢蘑菇MDA的影響Fig.7 Effect of composite coating agent on MDA in A.bisporus

2.3.6 復合涂膜劑對雙孢蘑菇菌落總數與腐爛指數的影響

由圖8可知，隨著貯藏時間的延長，CK和處理組的菌落總數與腐爛指數均呈上升趨勢，處理組的菌落總數與腐爛指數均顯著低于CK(P<0.05)。第15天時，處理組的菌落總數(7.40 CFU/g)較CK(8.87 CFU/g)低16.57%；處理組的腐爛指數為11.00%，相比于CK(14.70%)，降低了3.70%。復合涂膜劑處理可顯著抑制雙孢蘑菇貯藏期間的微生物侵染，降低其表面菌落總數。

圖8 復合涂膜劑對雙孢蘑菇菌落總數與腐爛指數的影響Fig.8 Effect of composite coating agent on the total number of colonies and decay rate of A.bisporus

2.3.7 復合涂膜劑對雙孢蘑菇體內POD、CAT、SOD、PPO酶活性影響

由圖9可知，CK和處理組的POD、CAT和SOD活性均隨貯藏時間的延長呈現先升高后下降的趨勢，而PPO隨著貯藏時間的延長呈下降趨勢。第9天時，處理組的POD、CAT、SOD活性出現高峰，值為0.13、 0.28、1.20 U/g，分別比CK(0.08、0.2、0.98 U/g)高出62.50%、40.00%、22.45%(圖9-A～圖9-C)。在第3天后，PPO活性均顯著低于CK(P<0.05)。第15天，處理組PPO活性為74.00 U/g，較CK(85.00 U/g)低12.94%(圖9-D)。復合涂膜劑在一定程度延緩了貯藏期間雙孢蘑菇體內POD、CAT、SOD活性的降低，抑制了其PPO活性的升高，有利于延長雙孢蘑菇耐貯性。

圖9 復合涂膜劑對雙孢蘑菇POD、CAT、SOD、PPO活性影響Fig.9 Effect of composite coating agent on POD, CAT, SOD and PPO activities of A. bisporus

3 討論

蜂膠中含有大量的黃酮、酚酸類、萜烯類等物質，這些酚類物質可成為自由基終止劑、金屬螯合劑和單線態氧淬滅劑，進而提升農產品的自身抗氧化能力，減弱組織損傷、酶促褐變[12-13,27]。且這些非離子化的親脂性分子可以滲入到微生物細胞膜內，破壞膜傳遞過程，并在細胞內解離而增加酸性，改變體系pH，增強抑菌效果[25-26]。蜂蠟是一種具有疏水性的天然脂類物質，能在果蔬表面形成一層透明薄膜，膜中的微孔通道可調節果實微環境氣體成分，使得其體內出現低氧環境，延長儲藏期[15-16,28]。蜂膠、蜂蠟復合涂膜劑具有良好的保鮮及抑菌效果，是開發天然、綠色保鮮劑的絕好材料。

雙孢蘑菇采后品質變化主要為失重和褐變。失重現象主要與失水和營養物質代謝相關[29]。褐變主要是由體內的PPO引起，PPO通過將酚類物質氧化為醌，進一步產生黑色素，從而導致蘑菇褐變[30]。本研究表明，復合涂膜劑能有效抑制雙孢蘑菇在貯藏期間的品質劣變(圖3、表6)、失重率(圖4)和可溶性蛋白消耗(圖6)，降低了呼吸強度(圖5)和褐變程度(圖7)。這可能與復合涂膜劑中蜂蠟有關，蜂蠟成膜后可阻止菇體內部的水分遷移，減少質量損失和營養成分的消耗，延長貯藏期[28]。POD、CAT、SOD是植物體內主要的活性氧清除劑，對抑制果蔬酶促褐變有極其重要的作用[31]。本研究表明，處理組POD、CAT、SOD的活性均高于CK(圖9-A～圖9-C)，而PPO的活性低于CK(圖9-D)，這可能是由于蜂蠟的阻隔作用，抑制了活性氧的產生；加上蜂膠中的黃酮、酚酸類物質共同作用使得處理組菇體內的POD、SOD、CAT活力升高，延緩氧化酶促褐變[12,27]。處理組PPO活性降低，可能是被蜂膠中金屬螯合離子、黃酮、酚酸類等物質所抑制[13]。蜂膠中的親脂性分子可以抑菌，使得本研究中處理組的微生物菌落數顯著低于CK(圖8)，這與曹紅剛等[19]研究相一致。

雙孢蘑菇是呼吸躍變型果實，采摘之后仍然進行呼吸作用和代謝活動，導致菌柄伸長、菌蓋開傘、菌體皺縮軟化等[4]。機械損傷和微生物侵染也會引起組織發生褐變、甚至腐爛變質，縮短了貨架期，降低食用和商品價值[32]。因此雙孢蘑菇的采后貯藏保鮮技術研究尤為重要。保鮮劑不僅能夠抑制腐敗微生物的侵染，還能降低食用菌采后呼吸作用。常用的化學保鮮劑如CaCl2、VC、焦亞硫酸鈉、檸檬酸、聚乙烯醇等，但易產生二次污染和殘毒等問題[33]。天然保鮮劑開發將是食用菌保鮮劑的發展方向。天然提取物如殼聚糖[34]、肉桂精油[35]和中草藥[36]等近年來常應用于食用菌保鮮，本實驗以蜂膠、蜂蠟作為主要材料，復合涂膜保鮮雙孢蘑菇，取得較好的保鮮效果。所用材料為蜜蜂產業的副產品，均為天然成分，綠色環保、且具可食用性。本研究為雙孢蘑菇保鮮提供一種新方法，也為可食性蜂膠蜂蠟復合涂膜劑的應用提供新思路。

4 結論

本研究利用響應面試驗設計優化蜂膠蜂蠟復合涂膜劑配方，并用最優復合比例進行雙孢蘑菇保鮮試驗。結果表明，復合涂膜劑最優配比為蜂膠溶液1.39%、蜂蠟溶液2.04%、吐溫80 2.01%。雙孢蘑菇經復合涂膜劑保鮮處理后，與CK相比，雙孢蘑菇貯藏期間的品質劣變、失重率、腐爛率、菌落總數、呼吸強度、MDA含量、PPO活性均顯著降低，菇體硬度、可溶性蛋白含量、POD、CAT、SOD活性均顯著升高。蜂膠蜂蠟復合涂膜劑能較好地保持雙孢蘑菇的感官品質和營養價值，有效延長貯藏時間。本研究提供了一種適合雙孢蘑菇的可食性涂膜保鮮方法。