QuEChERS -超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定禽蛋中7種喹諾酮類獸藥殘留

黃坤，范小龍，曹琦，韓智，張莉，王會(huì)霞*，郭嘉

1(湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢，430075)2(武漢工程大學(xué) 化工與制藥學(xué)院，綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢，430205)

喹諾酮類獸藥是人工合成的廣譜性抗菌類抗生素，其吸收效果好、毒性較低，因而被廣泛應(yīng)用于畜禽動(dòng)物的疾病防治[1-2]。但此類獸藥的濫用容易在動(dòng)物體內(nèi)殘留蓄積，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)，形成對(duì)其耐藥性從而影響相關(guān)臨床療效[3]。歐盟、聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織等均已指定多種喹諾酮類獸藥的最高殘留限量[4]，我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的第235號(hào)和2 292號(hào)公告也對(duì)喹諾酮類獸藥的使用做出了明確規(guī)定。目前動(dòng)物性食品中喹諾酮類獸藥殘留的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[5-8]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)[9-10]，但復(fù)雜基質(zhì)干擾使得液相色譜法的應(yīng)用受到限制，同時(shí)現(xiàn)行檢測(cè)方法還存在著前處理復(fù)雜、固相萃取耗時(shí)、回收率較低等問(wèn)題。而QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged, safe)是一種快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高效、可靠和安全的分散固相萃取技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于食品中的農(nóng)藥[11-13]獸藥的殘留檢測(cè)[14-16]，但是將該樣品前處理方法運(yùn)用于檢測(cè)禽蛋中喹諾酮類獸藥殘留的方法不多。針對(duì)以上問(wèn)題，以市售生鴨蛋為例，本研究建立了一種QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定禽蛋中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星和沙拉沙星共7種喹諾酮類獸藥殘留的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

XEVO TQD超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司；ME2002E和XS204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；RKTS-23050快速溶劑蒸發(fā)系統(tǒng)，英國(guó)Genevac公司；QuEChERS凈化劑(含PSA、C18、無(wú)水Na2SO4的混合粉末，混合質(zhì)量比為1∶1∶60)，實(shí)驗(yàn)室自配。

恩諾沙星(enrofloxacin，純度99.9%)、鹽酸環(huán)丙沙星(ciprofloxacin hydrochloride，純度94.0%)、氧氟沙星(ofloxacin，純度99.3%)、甲磺酸二水培氟沙星(pefloxacin mesylate dihydrate，純度99.0%)、諾氟沙星(norfloxacin，純度99.1%)、鹽酸洛美沙星(lomefloxacin hydrochloride，純度98.7%)、鹽酸沙拉沙星(sarafloxacin hydrochloride，純度91.2%)共7種標(biāo)準(zhǔn)品(均為固體)，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈和甲酸(均為色譜純)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；NaCl(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水系統(tǒng)，Millipore公司；禽蛋，來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室日常抽檢所用試驗(yàn)樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量的恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、氧氟沙星、甲磺酸二水培氟沙星、諾氟沙星、鹽酸洛美沙星和鹽酸沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，必要時(shí)可加入少量甲酸超聲助溶。將以上各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈稀釋，配制成各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度均為1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用初始流動(dòng)相稀釋成4～200 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，稱取與試樣基質(zhì)相同的陰性樣品，分別加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL，同1.3項(xiàng)下處理，作為基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品溶液的制備

稱取已均質(zhì)的禽蛋試樣5 g于50 mL離心管中，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的甲酸-乙腈和2 g NaCl，搖勻分散后渦旋提取2 min，以4 000 r/min離心2 min。 取全部上清液向其中加入QuEChERS凈化劑5 g，渦旋混勻2 min，以4 000 r/min離心2 min。上清液于45 ℃條件下快速溶劑蒸發(fā)至近干，加入初始比例流動(dòng)相2.0 mL渦旋復(fù)溶，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，濾液待分析。

1.4 色譜及質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

WatersAcquity UPLC超高效液相色譜儀；Waters BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A相為體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸，B相為乙腈；流速0.3 mL/min； 柱溫35 ℃；樣品池溫度10 ℃；進(jìn)樣量5 μL； 梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution conditions

1.4.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜儀選擇電噴霧離子源，正離子模式(ESI+)，毛細(xì)管電壓為2.65 kV，脫溶劑氣和錐孔氣流量分別設(shè)定為900和50 L/h，離子源溫度和脫溶劑氣溫度分別為150和350 ℃。在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下7種喹諾酮類獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(60 ng/mL)的總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 7種喹諾酮類獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms(TIC) for the standard solution of 7 quinolones

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜參數(shù)的選擇

2.1.1 色譜參數(shù)的選擇

本研究分別考察了乙腈-0.1%三乙胺、乙腈-水、乙腈-0.1%乙酸銨和乙腈-0.1%甲酸(均為體積分?jǐn)?shù))作為流動(dòng)相體系對(duì)喹諾酮類獸藥的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%三乙胺體系信號(hào)響應(yīng)較低，乙腈-水體系峰型拖尾，而乙腈-0.1%乙酸銨和乙腈-0.1%甲酸2種體系峰型較好，綜合分離效果、響應(yīng)強(qiáng)度、測(cè)定時(shí)間以及系統(tǒng)穩(wěn)定性考慮，最終選擇非鹽體系：乙腈和0.1%的甲酸作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，使得喹諾酮類獸藥的峰型尖銳對(duì)稱、保留時(shí)間適宜。

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

以10 μL/min的針泵流速注入200 ng/mL的7種喹諾酮類獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，確定較為合適的母離子掃描條件，再對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)掃描，篩選信號(hào)最強(qiáng)的離子對(duì)作為定量離子，信號(hào)次強(qiáng)的離子對(duì)作為定性離子對(duì)，得到多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件(MRM)：定量及定性離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量，詳見(jiàn)表2。

表2 7種喹諾酮類獸藥的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 MS conditions for 7 quinolones

注：*為定量子離子。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

大多數(shù)樣品中喹諾酮類獸藥殘留都是采用酸化或堿化的溶劑提取，現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20366—2006《動(dòng)物源產(chǎn)品中喹諾酮類殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[17]和GB/T 21312—2007《動(dòng)物源性食品中14

種喹諾酮獸藥殘留檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[18]分別采用了酸化乙腈和EDTA-Mcllvaine緩沖液(pH=4.0)。有研究表明高比例乙腈的提取液會(huì)導(dǎo)致常規(guī)固相萃取柱的回收率較低，而EDTA-Mcllvaine緩沖液提取時(shí)由于溶液難以澄清而導(dǎo)致堵塞固相萃取柱，2種提取方式均存在不足[19]。本實(shí)驗(yàn)選擇無(wú)需過(guò)柱的QuEChERS粉末進(jìn)行凈化處理，分別考察了5%甲酸-乙腈、5%甲酸-水、100%乙腈(均為體積分?jǐn)?shù))作為提取液進(jìn)行均質(zhì)提取的回收率，結(jié)果表明沉淀蛋白方面5%甲酸-水效果欠佳，5%甲酸-乙腈與100%乙腈效果相當(dāng)，而5%甲酸-乙腈提取回收率高于100%乙腈。因此采用5%甲酸-乙腈作為提取液，保證較高回收率的同時(shí)可大幅度提高實(shí)驗(yàn)效率。

2.3 方法的線性范圍、檢出限和定量限

按照1.2處理得到質(zhì)量濃度分別為2、5、10、20、40、60、80、100 ng/mL的基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.4和2.1項(xiàng)下所確定的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度X對(duì)定量離子的峰面積Y繪制各化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明7種喹諾酮類獸藥濃度在2～100 ng/mL線性關(guān)系良好，R2均大于0.995，詳見(jiàn)表3。以信噪比S/N=3結(jié)合空白基質(zhì)噪音響應(yīng)確定方法的檢出限(LOD)為0.3 μg/kg， 以S/N=10確定方法的定量限(LOQ)為1.0 μg/kg。

表3 線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear equations and coefficients

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

為了驗(yàn)證本方法測(cè)定禽蛋中7種喹諾酮類獸藥殘留的可行性和準(zhǔn)確性，試驗(yàn)采用空白生鴨蛋基質(zhì)樣品(已檢測(cè)過(guò)的陰性樣品)進(jìn)行加標(biāo)回收率驗(yàn)證，加標(biāo)水平分別為2、5、10 μg/kg，按照1.3項(xiàng)下方法處理，每個(gè)水平重復(fù)6次試驗(yàn)，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，見(jiàn)表4。結(jié)果表明，平均回收率為77.20%～98.47%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～6.2%，方法的準(zhǔn)確度和精密度符合實(shí)驗(yàn)室測(cè)定需求[20]。

表4 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Average recoveries and relative standard deviation

注：-為未檢出。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

按本研究所建立的方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室抽檢的一批80份產(chǎn)地各異的禽蛋樣品中喹諾酮類獸藥殘留進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果測(cè)得其中1份雞蛋和1份鴨蛋樣品不合格，分別是恩諾沙星(以恩諾沙星與環(huán)丙沙星之和計(jì))82.1 μg/kg和氧氟沙星18.6 μg/kg，表明相關(guān)養(yǎng)殖行業(yè)存在喹諾酮類獸藥濫用的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)該項(xiàng)目的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)與安全評(píng)估顯得極為重要。同時(shí)采用現(xiàn)行國(guó)標(biāo)方法GB/T 20366—2006和GB/T 21312—2007對(duì)不合格樣品進(jìn)行復(fù)測(cè)，測(cè)定結(jié)果與本方法完全一致。

3 結(jié)論

本研究建立了一種快速測(cè)定禽蛋中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星共7種喹諾酮類獸藥殘留的QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法有效解決了樣品處理過(guò)程中固相萃取柱堵塞與復(fù)雜基質(zhì)干擾等問(wèn)題，與常規(guī)方法相比分析過(guò)程快速、簡(jiǎn)單、回收率好、靈敏度高，滿足對(duì)禽蛋中喹諾酮類獸藥殘留測(cè)定的限量要求，能夠?yàn)榍莸凹跋嚓P(guān)農(nóng)產(chǎn)品的安全監(jiān)測(cè)及質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。