兩種鲊辣椒發酵過程中香氣特征及其差異分析

尹小慶，湯艷燕，杜木英*,武亞婷，武運，闞建全

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(中匈食品科學合作研究中心，重慶，400715)3(新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052)

鲊辣椒，又稱鲊海椒、酢辣椒、鲊廣椒，在湘西被稱為包谷酸辣子，是我國西南地區的一種傳統特色發酵食品。鲊辣椒是以鮮辣椒、大米粉或玉米粉為主要原料，按一定比例添加生姜、食鹽等輔料，經破碎混勻后于密閉容器中進行自然發酵而成。因其色澤鮮艷、酸辣可口、回味醇厚等特點受人們喜愛。既可單獨成菜，又能作為調味品。

目前，鲊辣椒的研究報道主要集中在微生物的分離鑒定[1-2]、發酵工藝的優化[3-5]和質量評價體系[6]的建立。只有少數文章研究鲊辣椒在發酵過程中營養成分[7]和功能成分[8-10]的變化。在評估鲊辣椒質量安全時，理化指標、微生物指標以及感官評定[11]都有確立，但是鲊辣椒的揮發性香氣成分卻鮮有報道。劉昕等[6]雖揭示了貴州幾種市售鲊辣椒中的揮發性風味物質，卻未對鲊辣椒中香氣成分含量隨發酵時間變化進行研究。但發酵時間對鲊辣椒的香氣物質的形成影響較大，且不同品種的辣椒引起的鲊辣椒風味差異還未見報道。

因此，本研究分別以二荊條和牛角椒為原料，按傳統工藝制作[12]，取發酵時間為0、7、15、22、30、45、60、90 d的鲊辣椒為研究對象，采用頂空固相微萃取(HS-SPME)結合氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用技術對鲊辣椒揮發性成分進行定性定量，借助主成分分析，聚類分析和香氣活度值分析，找出2種鲊辣椒的特征香氣物質以及不同發酵時期主要香氣成分對鲊辣椒風味的貢獻率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：按傳統工藝制作的二荊條和牛角椒鲊辣椒，分別取發酵時間為0、7、15、22、30、45、60、90 d的樣品用于實驗。

標準品：2-辛醇，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；C7～C40正構烷烴，購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

GC-MS-2010氣相色譜質譜聯用儀，日本島津公司；100 μm PDMS固相微萃取(SPME)裝置，美國Supelco公司；JA2003分析天平，上海精密科學儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 萃取方法

參考王巧碧等[13]的方法：稱取5 g左右的樣品置于20 mL頂空進樣瓶中，再加入10 μL 2-辛醇(500 mg/L)，加蓋密封。在50 ℃恒溫水浴平衡30 min后，將老化后的100 μm PDMS萃取頭插入頂空進樣瓶中，頂空吸附40 min，然后將萃取頭插入GC-MS進樣器中解析5 min，同時啟動儀器進行數據采集。

1.3.2 GC-MS分析

色譜條件：DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：柱溫箱起始溫度為40 ℃，保持2 min，先以10 ℃/min升溫到150 ℃，保持2 min，再以4 ℃/min升溫到250 ℃，保持5 min；柱流量1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；不分流進樣。質譜條件：電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；接口溫度250 ℃；質量掃描范圍40～400m/z。

1.3.3 定性定量分析

采用NIST05、NIST08等譜庫檢索和保留指數結合進行定性分析。各揮發性組分的保留指數(RI)由C7～C40正構烷烴的保留時間計算而得。RI[14]值按公式(1)進行計算：

(1)

式中：Rti、Rtn、Rtn+1分別為待測未知物、含n及n+1個碳原子的正構烷烴的保留時間(Rtn﹤Rti﹤Rtn+1)。

樣品中各揮發性組分的絕對含量按公式(2)進行計算[15]：

(2)

式中：ρ，內標的質量濃度，μg/μL；V，內標物體積，μL；Ai，各揮發性組分的峰面積；A，內標物質的峰面積；m，樣品質量，kg。

1.3.4 鲊辣椒特征香氣成分分析

采用香氣活度值(odor activity value，OAV)表征鲊辣椒中各香氣化合物對主體香氣成分的貢獻。當OAV >1時，認為該化合物對樣品的香氣有貢獻，且OAV越大表明該化合物個體貢獻越大[16]。OAV按公式(3)進行計算[17]：

(3)

式中：Ci，化合物的含量，μg/kg；Ti，該化合物的香氣閾值濃度，μg/kg。

1.3.5 數據分析與處理

每個實驗設3個平行，采用Excel 2016和SPSS 20.0對數據進行計算，并用Origin 8.6進行作圖。

2 結果與分析

2.1 鲊辣椒發酵過程中香氣成分分析

2種鲊辣椒發酵過程中的揮發性香氣成分的定性和定量分析結果見表1和表2。結合圖1和圖2可知，隨著發酵的進行，2種椒鲊辣椒揮發性成分的種類不斷增加，總揮發性成分含量均先增加后減少。

圖1 二荊條鲊辣椒中揮發性化合物含量的變化Fig.1 Changes of volatile compounds content in erjingtiao rice-chili during fermentation

圖2 牛角椒鲊辣椒發酵過程中揮發性化合物含量的變化Fig.2 Changes of volatile compounds content in niujiaojiao rice-chili during fermentation

在發酵45 d時，2種椒鲊辣椒揮發性成分的種類和含量均達到最大值。從發酵0～45 d，二荊條鲊辣椒揮發性成分增加了42種，其中酯類20種，萜類11種，烷烴類3種，酸類5種，醇類、醛類和吡嗪類各1種。而牛角椒鲊辣椒揮發性成分增加了26種，比二荊條鲊辣椒少16種且未檢測到酸類、醛類等揮發性物質。可見在發酵過程中，二荊條鲊辣椒比牛角椒鲊辣椒合成的揮發性物質的種類更為豐富。但是，從發酵0～45 d， 二荊條鲊辣椒揮發性成分含量增加了39.50 mg/kg，而牛角椒鲊辣椒椒卻增加了145.73 mg/kg。牛角椒鲊辣椒在發酵過程中增加的香氣物質的含量約是二荊條鲊辣椒的3.7倍。

在不同發酵期，鲊辣椒中揮發性成分的組成也不相同。發酵0 d時，二荊條鲊辣椒共檢出7種萜類化合物，分別是(+)-檸檬烯、(Z)-β-羅勒烯、芳樟醇、β-欖香烯、α-雪松烯、β-石竹烯和α-姜黃烯，其中(+)-檸檬烯含量最高，占總揮發性成分40%左右。7種萜類物質含量達24 878.43 μg/kg，占總含量的68.9%，而酯類和烷烴類分別占15%左右。

續表1

注：“-”表示未檢出。下同。

續表2

序號物質保留指數含量/(μg·kg-1)0 d7 d15 d22 d30 d45 d60 d90 d36萜類γ-松油烯1 06253.25101.741 241.041 443.311 395.521 223.302 712.371 717.8937芳樟醇1 100921.812 871.385 138.926 289.0915 964.8325 222.0812 545.265 255.1138側柏酮1 113-33.3552.7568.66181.50196.52190.24158.39394-萜烯醇1 187-352.09748.291 013.713 235.594 553.642 555.771 012.5940α-蓽澄茄油烯1 376---68.33281.18408.68219.10113.8641β-欖香烯1396490.64227.18531.95638.991 601.562 619.751 072.43494.9642α-柏木烯1 427251.88369.751 154.821 382.043 323.914 644.453 296.351 343.3943γ-蓽澄茄烯1 437--53.68147.57743.46709.57531.4461.3744反式-β-金合歡烯1 457----477.14542.11334.8273.1745α-雪松烯1 488--84.58882.571 459.731 325.181 459.17978.9546β-石竹烯14921 332.16419.601 029.661 222.992 847.977 334.412 568.991 269.2347α-愈創木烯1 507111.04130.31358.01432.201 291.851 661.451 189.49441.0548β-雪松烯1 51199.1953.27170.58213.86560.37540.08491.72108.3149α-姜黃烯1 519259.3569.57196.07235.01736.97982.27654.93246.5350δ-蓽澄茄烯1 52334.3784.02236.68291.341 067.361 581.41719.15277.6951橙花叔醇1 562----2 459.363 525.421 657.15656.8452柏木腦1 617776.13142.88243.67310.601 582.981 480.14--53吡嗪類2-甲氧基-3-異丁基吡嗪1 199----55.39113.1071.6624.1554酚類4-乙基愈創木酚1 300----36.9664.019.2413.6755烷烴類2-甲基十三烷1 36128.31169.54662.74819.051 769.802 945.931 848.90929.0456正十四烷1 402334.3765.13207.80244.41692.90735.31522.63209.0657正十五烷1 505529.8172.94160.91224.18847.302 077.331 590.76555.02582-甲基十五烷1 544591.10324.04581.69744.04458.98325.8249.6927.4759正十六烷1 62463.46170.87325.60398.881 244.141 511.70908.78440.47602-甲基二六烷1 663232.6239.7178.96102.69475.31604.96352.58243.8261正十七烷1 700493.4992.62155.88169.80572.30905.29498.38326.8362姥鮫烷1 647----606.92280.92418.28303.2263植烷1 742----129.57195.08132.03125.9264正十八烷1 806136.3341.4663.3278.85193.06245.15162.21102.35

發酵7 d后，萜類物質含量迅速下降，可能是微生物產生的各種修飾酶對碳骨架進一步修飾,如環氧化、羥基化、異構化、糖基化等[18]，使萜類化合物發生了轉化。發酵45 d后，雖然萜類化合物的含量降到20%左右，卻新出現了α-柏木烯、β-月桂烯、4-萜烯醇、香樹烯、長葉烯、(E)- β-金合歡烯、β-紫羅蘭酮、α-愈創木烯、β-雪松烯、δ-蓽澄茄烯、柏木腦。同時酯類含量增加到55%左右，酯類物質由微生物產生的酶催化生成，或者由醇類化合物和短鏈脂肪酸通過非酶催化的酯化反應生成[19]。由此可見，二荊條鲊辣椒發酵過程中主要實現了萜類物質的轉化和酯類物質的生成。

發酵0 d時，2種鲊辣椒共有的萜類物質包括(+)-檸檬烯、β-羅勒烯、芳樟醇、β-欖香烯、β-石竹烯和α-姜黃烯。除此之外，牛角椒鲊辣椒中還有β-月桂烯、萜品油烯、γ-松油烯、α-柏木烯、α-愈創木烯、β-雪松烯、δ-蓽澄茄烯、柏木腦和16種酯類物質，其中含量較高的是異戊酸乙酯、(Z)-4-癸烯酸乙酯、十四酸乙酯和棕櫚酸乙酯，這4種物質的含量占酯類化合物含量的80%左右。隨著發酵的進行，萜類和酯類化合物的含量不斷增加，并在發酵45 d時含量達到最大值。其中酯類物質中含量較高的有乙酸異戊酯、乙酸芳樟酯、(Z)-4-癸烯酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯和油酸乙酯，萜類物質含量較高的有β-月桂烯、(+)-檸檬烯、芳樟醇、α-柏木烯、β-石竹烯、橙花叔醇，這些萜類和酯類物質可能對鲊辣椒的風味有一定的貢獻。可見牛角椒鲊辣椒發酵過程中主要生成酯類和萜類化合物。2-甲氧基-3-異丁基吡嗪和4-乙基愈創木酚均在發酵30 d后檢出，說明這兩種物質是在發酵后生成的。

2.2 鲊辣椒發酵過程中特征香氣分析

如表3和表4所示，二荊條發酵0 d時，己酸乙酯、芳樟醇、(Z)-4-癸烯酸乙酯、(+)-檸檬烯、β-羅勒烯和β-石竹烯OAV﹥1，說明這6種物質對二荊條鮮辣椒香氣有貢獻；(+)-檸檬烯的OAV>1 000，說明它是二荊條鮮辣椒的主要香氣成分。發酵0 d的牛角椒中OAV﹥1的有9種，其中己酸乙酯和芳樟醇的OAV>100，說明這兩種物質可能是鮮牛角椒的特征香氣成分。發酵45 d后二荊條鲊辣椒中OAV>1的化合物共21種，酯類13種，萜類7種，吡嗪類1種。其中丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、己酸己酯、芳樟醇、β-紫羅蘭酮和2-甲氧基-3-異丁基吡嗪的OAV>100，說明這5種物質是二荊條鲊辣椒的主要香氣成分。而牛角椒鲊辣椒中OAV﹥1的化合物增加至25種，酯類11種、萜類13種、吡嗪類1種。其中丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、β-月桂烯、(+)-檸檬烯、芳樟醇、4-萜烯醇、β-石竹烯、橙花叔醇和2-甲氧基-3-異丁基吡嗪的OAV>100，可能是牛角椒鲊辣椒的特征香氣成分。

表3 二荊條鲊辣椒中主要成分的OAVTable 3 The OAVs of major volatile compounds in erjingtiao rice-chili

酯類化合物是食品中重要的風味物質，主要賦予食品特殊的水果香味[20]。發酵45～60 d時，二荊條和牛角椒鲊辣椒分別檢出13和11種對風味有貢獻的酯類化合物。其中丁酸乙酯具有強烈的菠蘿和鳳梨的香氣，己酸乙酯有強烈的甜的果香，乙酸己酯具有青香和果香，且有蘋果和梨的味道[21]。這3種酯類化合物閾值低，OAV均大于100，是兩種鲊辣椒中共有的特征香氣成分。2-甲基丁酸乙酯具有成熟的漿果類香氣，閾值僅0.3 μg/kg，是牛角椒鲊辣椒獨有的特征香氣成分。己酸己酯具有青香、藥草香和熱帶水果的香氣，是二荊條鲊辣椒發酵45 d時的特征香氣成分，但不是其他發酵階段的特征香氣成分。

萜類化合物主要存在于陸生植物中，具有生理活性且對天然風味有一定的貢獻。兩種鲊辣椒在發酵45 d時萜類化合物的數量和含量最高。發酵45～60 d 時，兩種鲊辣椒中OAV>1的萜類化合物分別有7種和14種。芳樟醇具有漿果和玫瑰的香氣，是兩種鲊辣椒發酵45～60 d時共有的特征香氣物質。β-紫羅蘭酮具有覆盆子和紫羅蘭的香氣，是二荊條鲊辣椒獨有的特征香氣成分。β-月桂烯具有青香、木香和果香，(+)-檸檬烯具有柑橘和檸檬的香氣，4-萜烯醇具有青香、木香和辛香，β-石竹烯具有辛香、木香和柑橘的香氣，橙花叔醇具有青香、木香和花香[22]，這5種萜類化合物是牛角椒鲊辣椒發酵45 d時的特征香氣成分，而牛角椒鲊辣椒發酵60 d后4-萜烯醇和β-石竹烯不再是其特征香氣成分。

烴類化合物雖然在鲊辣椒中含量高，但由于烴類化合物的風味閾值高，對鲊辣椒的風味貢獻小，所以烴類化合物不是鲊辣椒的特征香氣成分。2-甲氧基-3-異丁基吡嗪具有類似胡椒和咖啡的香氣，是青辣椒的主要香氣成分[23]，雖然含量低但其閾值僅為0.016 μg/kg，且OAV在1 000以上，所以是鲊辣椒發酵 30 d后的特征香氣成分。2種鲊辣椒發酵前22 d均未檢測到2-甲氧基-3-異丁基吡嗪，可能是辣椒變紅后含量降低了[24]。而在發酵后期能檢測到這種物質是因為發生Strecker反應，生成吡嗪類物質[25]。

綜上可知，鲊辣椒各發酵階段的特征風味成分差別較大。且發酵45 d后，隨發酵時間的延長，2種鲊辣椒中大部分揮發性化合物的OAV逐漸降低，說明鲊辣椒的香氣在不斷減弱。β-紫羅蘭酮是二荊條鲊辣椒中獨有的特征香氣成分，2-甲基丁酸乙酯、β-月桂烯、(+)-檸檬烯和橙花叔醇是牛角椒鲊辣椒中獨有的特征香氣成分，說明2種鲊辣椒的風味各有特色。張曉輝等[26]研究發現酯類和萜類物質不僅是新鮮辣椒的主要呈香物質，也是發酵辣椒的主要香氣成分，本文中2種鲊辣椒主要呈香物質也是酯類和萜類。己酸乙酯、乙酸己酯和芳樟醇是發酵辣椒中的主要香氣成分[27]。在發酵45～60 d時，2種鲊辣椒共有的特征香氣成分除了這3種，還包括丁酸乙酯和2-甲氧基-3-異丁基吡嗪。

表4 牛角椒鲊辣椒中主要成分的OAVTable 4 The OAVs of major volatile compounds in niujiaojiao rice-chili

2.3 鲊辣椒發酵過程中主成分分析與聚類分析

2.3.1 二荊條鲊辣椒主成分分析與聚類分析

由表5可知，二荊條鲊辣椒揮發性物質經主成分分析后可提取5個主成分，累計貢獻率達到99.489%，說明這5個主成分能夠反映樣本信息量。通過SPSS 20.0分析不同發酵階段二荊條鲊辣椒在各個主成分中的得分，然后建立綜合評價函數F=0.709 6F1+0.123F2+0.112 4F3+0.033 3F4+0.016 7F5。綜合得分排序為發酵45 d>60 d>0 d>30 d>90 d>22 d>7 d>15 d。表明二荊條鲊辣椒在發酵45 d時鲊辣椒香氣成分最佳。

聚類分析作為一種無管理模式的識別方法，所得結果一定程度上取決于聚類距離的計算、聚類的方法等。本試驗采用的平方歐式距離類平均法，應用SPSS 20.0進行系統聚類分析，將牛角椒鲊辣椒66種香氣物質的相對含量作為特征向量以平方歐氏距離、組間連接法為準則進行聚類分析，結果見圖3。

表5 二荊條鲊辣椒的主成分分析結果Table 5 Principal component analysis results of erjingtiao rice-chili

圖3 二荊條鲊辣椒發酵過程中揮發性成分含量的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of volatile aroma components in erjingtiao rice-chili during fermentation

不同發酵期鲊辣椒在相似系數12.5處可分為3類。第一類包括發酵45 d和60 d，第二類包括發酵0 d，剩余的歸為第3類。發酵45 d的二荊條鲊辣椒得分最高，發酵60 d的二荊條鲊辣椒綜合得分第二，兩者被歸為第一類，表明二荊條鲊辣椒發酵45～60 d風味較佳。

2.3.2 牛角椒鲊辣椒主成分分析與聚類分析

由表6可知，牛角椒鲊辣椒揮發性物質可提取5個主成分，累計貢獻率達到99.062%，說明這5個主成分能夠反映樣本信息量。通過軟件分析不同發酵階段牛角椒鲊辣椒在各個主成分中的得分，建立綜合評價函數F=0.778 6F1+0.093F2+0.053 1F3+0.044 6F4+0.0213F5。綜合得分排序為發酵45 d>60 d>30 d>22 d>90 d>15 d>0 d>7 d。可見發酵45 d時牛角椒鲊辣椒香氣成分最佳，這與二荊條鲊辣椒，與葉陵等[29]研究粳米鲊辣椒所得的結論一致。

與二荊條鲊辣椒聚類分析方式相同，結果見圖4。不同發酵期牛角椒鲊辣椒在相似系數6處可分為三類。第一類包括發酵45 d，第二類包括發酵30 d和60 d，剩余的歸為第三類。發酵45 d得分最高且歸為第一類。發酵60 d與發酵30 d綜合得分排在第二和第三且被歸為第二類，表明牛角椒鲊辣椒發酵30～60 d風味較佳。

表6 牛角椒鲊辣椒的主成分分析結果Table 6 Principal component analysis results of niujiaojiao rice-chili

圖4 牛角椒鲊辣椒發酵過程中揮發性成分含量的聚類分析Fig.4 Cluster analysis of volatile aroma components in niujiaojiao rice-chili during fermentation

3 結論

二荊條和牛角椒鲊辣椒發酵過程中總揮發性成分含量均先增加后減少，在發酵45 d時含量達到最大值，化合物種類均在65種左右。但在不同發酵階段，鲊辣椒中揮發性成分的組成差異較大。β-紫羅蘭酮是二荊條鲊辣椒中獨有的特征香氣成分，2-甲基丁酸乙酯、β-月桂烯、(+)-檸檬烯和橙花叔醇是牛角椒鲊辣椒中獨有的特征香氣成分。兩種鲊辣椒的特征風味物質是丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、芳樟醇和2-甲氧基-3-異丁基吡嗪。聚類分析表明二荊條鲊辣椒發酵45～60 d風味較佳，而牛角椒鲊辣椒發酵30～60 d 風味較佳。經主成分分析，2種鲊辣椒香氣物質均在發酵45 d時風味最佳。本研究對通過控制發酵時間來獲得不同鲊辣椒的最佳風味品質具有重要的參考意義。鲊辣椒在發酵過程中，風味物質的形成與微生物的動態變化密不可分。要進一步豐富鲊辣椒的風味，需對鲊辣椒風味形成機理與微生物的關系進行研究。