Prohibitin在結直腸癌組織中表達及其與預后的關系

唐 娜，周 略*，袁 健 （. 南方科技大學第一附屬醫院、暨南大學第二臨床醫學院、深圳市人民醫院，廣東深圳 58020；2. 廣東藥科大學病理學與病理生理學系，廣東廣州 50006）

結直腸癌居全世界惡性腫瘤發病率及病死率的第3位[1-4]。Prohibitin(PHB)隸屬于SPFH家族，維持線粒體蛋白的穩定性，調節細胞發育、增生、轉錄及凋亡等生物學功能，在腫瘤的發病機制研究中發揮重要作用[5-11]。本研究主要運用免疫組化方法觀察PHB在人結直腸癌標本中的表達，研究其與患者性別、年齡、部位、分期、預后等的關系，為更好評估預后、尋找新治療靶點提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 臨床材料

2001年1月至2005年12月南方醫科大學附屬南方醫院臨床確診的結直腸癌，蠟塊400例。入組標準：所有患者術前均未接受放療或化療。收集患者相關的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤大小及部位、淋巴結轉移、血管侵犯、分化程度和臨床分期(參照美國《AJCC癌癥分期手冊》第7版)，并附完整的隨訪資料(0～132個月)。對其中的388例標本進行CD31免疫組化檢測，分析有無血管侵犯。

1.2 方法

標本經10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋的結直腸癌組織蠟塊，連續切片，片厚2 μm，常規HE染色。操作步驟按照試劑說明書進行，在0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中高壓修復加熱3 min進行抗原修復，PHB一抗(1:500)、CD31一抗(1:100)室溫孵育60 min，試劑盒A液室溫孵育30 min，上述各步驟間用PBS洗片3次。二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，光鏡觀察。陰性對照以PBS代替一抗。兔抗人PHB單克隆抗體購自Eptomics公司；鼠抗人CD31單克隆抗體購自中杉金橋公司；二步法抗兔/抗鼠通用性免疫組化檢測試劑盒購自基因公司。

1.3 結果判斷

陽性結果判定以細胞漿內出現棕黃色染色或棕色顆粒為陽性細胞。由2名有經驗的病理科醫師雙盲閱片，采取之前文獻的評估方法[12]，分別隨機計數1 000 個細胞，計算不同表達強度癌細胞表達的百分率。陽性強度就看胞質染色的染色強度，陰性、淡黃色、黃色、棕褐色，分別標記為陰性(－)、弱陽性(+)、中度陽性(++)和強陽性(+++)，分別乘以0、1、2、3，相加得到該病例的陽性表達計分。

1.4 統計學處理

用SPSS 19.0軟件進行數據分析，蛋白表達與臨床病理學參數的比較用Pearson卡方檢驗。免疫組化檢測結果與患者術后生存時間的比較采用生存分析的Log-Rank檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PHB在結直腸癌組織中的表達

PHB在個別正常結腸腺體的基底部單個細胞表達，定位于細胞核內，類似干細胞分布特征(圖1 A、B)。結直腸原發癌組織中僅少量癌細胞表達PHB，未發生轉移的高分化腺癌，部分癌細胞腺腔緣表達PHB(朝向腺腔中心區域)，呈向心性表達方式(圖1 C)。伴有淋巴結轉移、遠隔器官轉移的結直腸癌患者原發癌組織內PHB呈離心性表達(朝向間質區域)，表現為癌巢周邊部突出于癌性腺腔的個別癌細胞、侵入間質的癌細胞和侵入脈管內的癌細胞表達PHB(圖1 D～F)；PHB陽性的癌細胞面對間質區域細胞漿內PHB強表達，而朝向癌巢中心區域細胞漿內PHB弱表達(圖1 D)，PHB表達模式與癌組織侵襲的臨床標本和癌組織侵犯血管的檢測證據(圖2、3)，浸潤間質的單個癌細胞、簇狀癌細胞與脈管內浸潤的癌細胞一側強表達PHB。

圖1 Prohibitin在結直腸正常黏膜與癌組織內的表達

圖2 PHB表達模式與癌組織侵襲的臨床標本檢測證據

圖3 PHB侵襲血管的臨床標本檢測證據

2.2 免疫組化結果與患者臨床資料的關系分析

2.2.1 PHB表達與患者性別、年齡、分化程度、臨床分級及淋巴結轉移等臨床特征的關系 本組400例結直腸癌組織中，248例PHB呈陽性表達，152例PHB呈陰性表達。不同性別、年齡(<60歲與≥60歲)、腫瘤分化程度、腫瘤大小(<4 cm與≥4 cm)、臨床分期、有/無淋巴結轉移患者PHB蛋白表達的差異無統計學意義(P>0.05)；不同腫瘤部位(結腸、直腸)及有或無血管侵犯患者PHB蛋白表達的差異則有統計學意義(P<0.01或0.05)。詳見表1。

表1 PHB蛋白表達與結直腸癌患者臨床特征的關系 (例)

接上表

2.2.2 PHB蛋白表達與結直腸癌患者術后生存時間的關系 應用Log-Rank生存分析法分析PHB蛋白的表達與結直腸癌患者術后生存時間，PHB陽性與陰性的患者中位生存期分別為90.9和87.7個月，兩者比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2.3 PHB向心性分布、離心性分布與結直腸癌預后的關系 PHB陽性表達的結直腸癌組織中，呈離心性表達84例，呈向心性表達164例，離心性分布較向心性分布患者中位生存時間短，分別為64.1個月和108.6個月，PHB向心性表達的結直腸癌患者中位生存期明顯長于離心性表達方式的患者(P<0.01)。

圖4 結直腸癌PHB表達方式臨床隨訪分析

3 討論

PHB與腫瘤發生、增殖與轉移的相關性不同研究結論不同。大多數研究認為Ras激活后，與定位于細胞質膜下的PHB直接結合，導致C-Raf激活，Ras-Raf途徑促進細胞增殖、轉化和遷移，在宮頸癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌、膀胱癌、前列腺癌、鼻咽癌和卵巢癌中PHB高表達[5-6,13-16]；另有研究認為PHB阻止細胞從G1期向S期轉變，阻斷細胞轉錄而抑制癌細胞增殖[5]。高轉移潛能的肝癌細胞系PHB表達明顯增強，癌細胞遷移能力顯著增高[17]，Ras-Raf激活誘導宮頸癌細胞轉移，依賴于PHB的介導[18-19]。

本研究顯示，PHB在正常結腸黏膜腺體與間質內幾乎不表達，僅在個別患者正常結腸腺體的基底部見單個細胞表達，定位于細胞核內，與正常干細胞數量和分布位置類似。結直腸原發癌中發現僅有少量癌細胞表達(與CSC占腫瘤細胞群的1/1000～1/100相一致)PHB，而朝向癌巢中心區域細胞漿內PHB弱表達，癌巢周邊部突出于癌性腺腔的個別癌細胞、侵入間質的癌細胞和侵入脈管內的癌細胞表達PHB，表明PHB的表達與癌細胞將要逃離原發灶和侵襲行為有關。PHB在結直腸癌組織內表達具有向心性與離心性兩種表達方式，且在同一細胞內呈極性表達，提示PHB參與CSC的增殖分化和遷移的調節，PHB表達區域可能促進CSC遷移相關的前導緣形成。更有趣的是，我們發現浸潤間質的單個癌細胞、簇狀癌細胞與脈管內浸潤的癌細胞一側強表達PHB，提示PHB誘導遷移癌細胞的細胞骨架形成，細胞外基質、血管內皮細胞可能對遷移癌細胞產生趨化作用。這些結果提示，PHB在結直腸癌癌細胞遷移過程中起重要作用。

本文結果顯示，不同性別、年齡(<60歲與≥60歲)、腫瘤分化程度、腫瘤大小(<4 cm與≥4 cm)、臨床分期、有/無淋巴結轉移患者PHB蛋白表達的差異無統計學意義(P>0.05)，不同腫瘤部位(結腸、直腸)及有/無血管侵犯患者PHB蛋白表達的差異有統計學意義(P<0.01或0.05)。PHB向心性與離心性的兩種表達模式與患者預后密切相關，離心性表達者預后明顯差于向心性表達者(P<0.001)。

綜上所述，PHB的表達模式可作為結直腸癌患者預后的有效指標，PHB離心性表達是結直腸癌患者預后不良特征之一。這些發現為PHB在結直腸癌中轉移機制中的作用提供了新方向，其相關分子機制有待于進一步研究。