SNC1及其調控研究進展

詹薔 黃紅晶 夏石頭

關鍵詞 SNC1 R基因 水楊酸 植物免疫 基因調控

中圖分類號：Q786 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? DOI：10.16400/j.cnki.kjdkx.2019.09.025

Keywords SNC1; R gene; SA; plant immunity; gene regulation

植物經常遭受各種病原體的攻擊，并且已經進化出一系列的防御機制。第一層防御是病原體相關分子模式激發(fā)的免疫反應，即模式激活免疫反應（PAMP-triggered，PTI）。[1]在此基礎上，植物已經進化出了一種由抗性（R）蛋白介導的更強、更快速的第二防御層。R基因編碼的蛋白是植物抗性基因編碼蛋白，能有效針對病原菌快速誘導防御反應。在植物遭受病原體感染后R蛋白被激活，并導致植物局部程序性死亡，即超敏反應（HR）。[2]HR伴隨著一系列生理變化，包括離子通量的改變，防御激素水楊酸（SA）的積累，致病相關（PR）基因的誘導和氧化爆發(fā)。[2]而HR往往會導致除感染點外的長期的全身性和廣譜抗病性，即系統獲得性抗性（SAR）。而R蛋白的上調活化對植物生長是有害的，會嚴重影響擬南芥植株的細胞分生能力和抗氧化能力，[3]導致細胞數目大幅度減少，在沒有病原菌攻擊時，抗性蛋白水平須受嚴格控制，以防止抗性途徑不必要激活而導致自身免疫的潛在傷害與生長缺陷。

1 SNC1的克隆及其功能

擬南芥SNC1是植物細胞內的一個位于抗病信號途徑上游的TIR-NB-LRR類R蛋白編碼基因，在NB和LRR結構域之間的連接區(qū)，一個賴氨酸取代谷氨酸后導致了snc1突變體在沒有致病菌感染情況下的自身免疫激活，[4]從而組成型激活了病程相關蛋白（PR蛋白）的持續(xù)高表達，顯著提升了snc1植株對細菌病原體和真菌病原體抗性。snc1的自身免疫表型包括株型矮小，水楊酸（SA）含量顯著的提高，PR基因的組成型表達，對強毒性病原菌如P.s.m ES4326 和卵菌H.a.Noco2的抵抗力的顯著增強。[4]SNC1基因位于哥倫比亞（Col）野生型植株4號染色體上的RPP4簇中，與RPP4和RPP5有高度同源性，氨基酸同源性達到70%。加拿大不列顛哥倫比亞大學李昕教授實驗室利用多種誘變策略篩選snc1抑制劑子突變體，獲得了多個snc1的修飾子（mos）突變體。到目前為止，已有13個新的MOS基因通過圖位克隆（11）和T-DNA標記（2）被克隆出來。這些基因的編碼蛋白質參與RNA處理、核質轉運、蛋白質修飾和基因表達的表觀遺傳控制等。MOS的不同功能表明R蛋白介導的抗性的激活是高度復雜的。[5]

2 SNC1轉錄水平的調控

研究表明MOS1和MOS9都可在轉錄水平上調節(jié)SNC1的表達。MOS1基因編碼的蛋白質有一個在動植物中都高度保守的結構域BAT2，其突變基因mos1可抑制snc1基因的表達。[4]試驗證據表明：在mos1突變體中，雖然snc1上游的DNA甲基化改變，但與snc1表達水平的抑制無關;此外，轉基因snc1在mos1中的表達沒有改變;以及通過引入DDM1（一個表觀遺傳調節(jié)因子）可以減輕snc1表達水平的抑制。這表明MOS1很可能不直接在DNA甲基化中發(fā)揮作用，并且這些在進化上含有這些保守的BAT2結構域的蛋白和DDM1可能具有拮抗作用，在染色質水平上對SNC1的表達進行調控。[4]

同時，MOS1直接與PCF1（TCP）轉錄因子TCP15相互作用以及增強其與啟動子的結合以激活SNC1的表達，并且MOS1和TCP15與SNC1啟動子相關聯位置是相同或相鄰的。[5]MOS1與酵母中的TCP15蛋白直接相互作用，通過增強TCP15與SNC1啟動子的結合從而加強TCP15與SNC1啟動子的關聯調節(jié)其表達并因此調節(jié)免疫應答。說明擬南芥TCP15及其同源物與MOS1相互作用并介導MOS1在核內復制和免疫反應中的功能。

雖然MOS9編碼一種功能未知的植物特異蛋白，但是MOS9的免疫共沉淀及質譜分析表明，ATXR7是一種與MOS9相關的蛋白。在功能缺失型突變體mos9中，SNC1和另一個編碼R基因的TR-NB-LRR基因RPP4的表達水平會有所下降;并且ATXR7是一套含有H3K4的甲基化酶，通過大量甲基化[6]而激活FLC，這表明MOS9可能通過H3K4me3染色質的修飾來調控R基因轉錄。

黃酮類化合物也與植物防御有關，既可以作為響應病原體攻擊而誘導的植物毒素，也可以作為植物免疫反應特異性抑制的代謝物。[7]CHS作為核定位蛋白，是組裝類黃酮酶復合物的中樞。與CHS相互作用可以增強MOS9蛋白的穩(wěn)定性，過量表達該蛋白質的幼苗的高分辨代謝物譜，與MOS9與CHS的相互作用直接或間接改變類黃酮代謝的模型一致，[8]這表明類黃酮酶復合物可能是相互作用蛋白質網絡的一部分，通過一種新的機制將通路的酶和終產物偶聯到特定的生理功能如植物防御等。

3 SNC1剪切水平的調控

MOS2是一種含有一個G片段和兩個KOW基序的核蛋白，是CC-和TIR-NB-LRR R蛋白介導的抗性和對P.s.m.ES4326的基本抗性所必需的。有實驗證據表明，來自細菌延伸因子NusG的KOW基序已顯示出核酸結合活性，并與tudor的蛋白-蛋白相互作用基序具有相同的結構同源性;[9]人的MOS2同源體GPKOW以依賴蛋白激酶A的方式與RNA結合;酵母同源蛋白SPP2是pre-mRNA剪接的第一步RNA切割所必需的蛋白質。而SPP2的G-path結構域與Prp2有關，Prp2是一種RNA依賴的ATP酶，能激活剪接體。[10]所以MOS2可以與RNA結合在剪接中起作用，也可能通過它的KOW基序與其他蛋白質相互作用。

MOS4是一種核蛋白，可用于抗P.s.m.ES4326以及TIR-和CC-NB-LRR-型R蛋白-介導抗性。在擬南芥中，它和其他23種蛋白質一起形成一個高度保守的剪接體相關復合體，稱為MOS4相關復合體（MAC）。[11]所有被檢測的MAC組分單突變體都是可存活的，但顯示出多向性缺陷，而雙突變體組合致命。這表明，雖然單個MAC組件可能參與調節(jié)許多不同的生物過程，但這個復合體作為一個整體是某些基本功能所必需的。[11]研究證明，酵母和人的同源復合物涉及到剪接小體組裝和前mRNA剪接且這個復合體具有高度保守性，因此MAC在植物中也有相關的作用，故包含MOS4在內的幾個MAC組件最近被證明是正確拼接RPS4和SNC1所必需的。[12]

雖然還沒有直接的證據證明MOS2和MAC具有同源性，但在人和酵母中MOS2的同源物被認為是剪接體相關復合物的組成部分，且MOS2也被證明是SNC1剪接所必需的，我們可以進一步推斷MOS2可能與MAC結合，參加mRNA前體的加工。

MOS12是P.s.m.ES4326以及R蛋白介導的抗性所必需的，編碼富含精氨酸的蛋白，其在氨基酸序列上具有兩個細胞周期蛋白結構域，主要是那些屬于TR-NB-LRR類的蛋白質的基礎抗性所必需的。[12]mos12-1是從MOS中篩選出的等位基因包含一個內含子剪接連接點突變，導致蛋白質的截短，而截短的蛋白質可能仍有部分功能，因為缺失的mos12-2T-DNA插入等位基因是致死的，說明該基因在植物的生長發(fā)育中具有重要的作用。與MOS12具有同源性的是人細胞周期蛋白L（Cyclin L），由于它與剪接因子和體外刺激剪接的能力有關，推測它參與了mRNA剪接。[12]植物防御反應可能部分通過R基因轉錄子的選擇性剪接來調節(jié)。在煙草中，R基因N的轉錄子在病菌攻擊后被交替拼接，兩種剪接變體都不能單獨誘導防御反應輸出，所以認為全長度和截短的N蛋白的特定比例是對煙草花葉病毒的完全抗性所必需的。雖然R基因的選擇性剪接主要發(fā)生在TIR-NB-LRR轉錄上，但也有報道稱有CC-NB-LRR基因轉錄選擇性剪接。[13]

4 SNC1轉錄子出核運輸的調控

mos3和mos11突變體都抑制了snc1的組成型自身免疫表型。[14]MOS3和MOS11都是mRNA成功出核所必需的，MOS3定位于核邊緣，而MOS11存在于核矩陣中，表明MOS11可能在mRNA出核過程中在MOS3之前發(fā)揮作用。[14]此外，單突變體mos3顯示出對強毒致病菌和非病毒致病菌的易感性，而在mos11單突變體中沒有觀察到類似形狀，說明MOS3在基礎防御和R蛋白介導的防御中起著重要的作用。MOS11編碼人CIP 29的同源蛋白，一種增強RNA解旋酶DDX 39活性的RNA伴侶，[15]在植物mRNA輸出過程中可能作為類似復合體的一部分發(fā)揮作用。

MOS3和與mRNA的輸出有關的Nup 96（哺乳動物中）和Nup 145（酵母中）同源。Nup 96作為Nup107-160核孔亞復合體的一部分，在小鼠中，功能缺失的Nup96等位基因在純合子和雜合子的免疫系統嚴重受損時會導致小鼠死亡，表明Nup 96在哺乳動物先天免疫和適應性免疫中都有作用。[16]在擬南芥中，MOS3被認為是同源復合體的一部分，最近還發(fā)現了包括Nup160和Seh1在內的其他復雜成分被用于本底抗性和TIR-NB-LRR介導的抗性。[17]雖然目前尚不清楚非特異性mRNA輸出的一般缺陷如何損害R蛋白介導的免疫，而不造成嚴重發(fā)展后果的一種可能性假設是植物已經進化成更具抗御力的植物，在只有一種Nup107-160復合體的損失不會導致致命，而nup96 nup160的雙突變體是幼苗致死的。

TREX（TRanscription-EXport）是一種多蛋白復合物，在協調mRNA的合成，加工以及核輸出方面發(fā)揮著核心作用。近期研究[18]表明擬南芥THO/TREX組件TEX1在功能上與MOS11相互作用，調節(jié)mRNA的出口和替代剪接。tex1mos11雙突變植物在營養(yǎng)和生殖發(fā)育方面顯示出明顯的缺陷，相對于mos11 導致的miR173水平降低以及核中mRNA積累增加和tex1導致的tasiRNA的水平降低及未檢測到mRNA輸出缺陷，tex1mos11雙突變體的mRNA輸出缺陷明顯增強。而TEX1的亞核分布基本上與剪接相關的SR蛋白的亞核分布重疊，并且在tex1中某些可變剪接事件的比例被改變，這表明擬南芥TEX1和MOS11參與mRNA和miRNA的生物發(fā)生的不同步驟，并且它們在某些方面相互作用，在其他方面獨立作用。

5 SNC1蛋白核質轉運的調控

對MOS6、MOS7和MOS14的研究揭示了核質蛋白在植物防御調控中的重要作用。防御調節(jié)因子對于進出核的調整似乎在提高植物的有效免疫力方面起著關鍵作用。

mos6突變等位基因是在snc1或snc1npr1背景的抑制基因篩選中發(fā)現的基因。[19]單突變體mos6對H.a.Noco2的敏感性增強，但對P.s.m.ES4326的抗性無變化，表明MOS6可能在細胞感染的基礎防御中起著特殊的作用。綠色熒光蛋白（GFP）定位表明它集中在核內，這支持了它是一種功能性的重要 蛋白的觀點。[19]對MOS6基因的圖位克隆表明，該基因編碼入核蛋白 3。MOS6蛋白具有入核蛋白 的典型特征，包括入核蛋白 結合區(qū)和NLS結合袋。

最近，L€黡ke D等[20]發(fā)現了剪短的NLR-NBS13蛋白（TN13），選擇性地與植物中的MOS6結合，但不與其最近的同源蛋白importin- 6結合，這種結合是對Pst DC3000 AvrPto/AvrPtoB的基礎抗性所必需的。在未受攻擊的組織中，TN13通過其C-末端NLS在ER的細胞質側與預先形成的復合物中的MOS6結合。在病原體刺激下，TN13通過蛋白酶從ER膜釋放。從ER膜釋放TN13-MOS6復合物可能允許另一個MOS6分子進入TN13的N末端的第二個NLS，并加速MOS6和入核蛋白- 的入核。在ER膜上形成預先形成的TN13-MOS6核輸入復合物提供了快速刺激誘導的轉運進入細胞核的機會，其中TN13可以激活防御反應。

MOS7在動物中編碼一個與Nup88同源的蛋白，參與核蛋白的輸出。[21]MOS7是擬南芥基因組中的一個單拷貝基因，而mos7-2缺失的T-DNA插入等位基因是致命的，因此野生型MOS7很可能是一般核蛋白保留所必需的。除參與snc1介導的防御途徑外，MOS7也被認為在其他R蛋白介導的基礎防御和防御中起著重要的作用。MOS 7定位于核邊緣，表明其在擬南芥中作為核孔蛋白的潛在作用。

MOS14是擬南芥中的一個單拷貝基因，在基礎抗性和某些TR-NB-LRR蛋白介導的抗性信號通路中都是必需的中間產物。[22]它編碼與后生動物轉運素-SR蛋白（TRN-SR）同源的核蛋白，TRN-SR是入核蛋白受體，在識別核定位序列（NLS）時通過核孔復合體（NPC）介導蛋白質的入核。mos14-1突變體植株中SNC1和RPS4的剪接模式發(fā)生了改變，由這些蛋白介導的抗性減弱。

6 SNC1的轉錄共抑制

MOS 10編碼一種與無頂體高度相似的核蛋白（TPL），[23]是一種轉錄核心阻遏物，因此，MOS10被重新命名為TPR1。TPR 1是轉錄抑制因子，即TPR1通過抑制負調控因子正調控SNC1介導的免疫反應。TPR1的過表達導致類似于snc1突變體中觀察到的防御表型的本構激活，包括SA積累的增加、PR基因的表達及對H.a. Noco2抗性的增強。[24]TPR1及其近似同源物的敲除或TPR1的SUMO化修飾會損害SNC1和其他幾種TIR-NB-LRR型R蛋白介導的免疫，TPR1去SUMO化或過表達，增強了TPR1的轉錄抑制活性和TPR1-HDA19互作，減弱TPR1-SNC1互作，使植株表現出更強的免疫作用。[25]TPR1與SNC1和組蛋白去乙酰化酶（HDA19）形成復合物。免疫共沉淀實驗表明TPR1與HDA19體內有聯系組蛋白去乙酰化酶從組蛋白賴氨酸殘基中去除乙酰基，從而增強DNA凝聚，進而抑制轉錄。

最近研究表明，[26]miRNA導致的缺陷可能是由于MIR基因的轉錄減少，而核SNC1可能與其互作蛋白TPR1一起通過抑制MIR的轉錄來抑制miRNA的發(fā)生。SNC1和TPR1還抑制來自3個R基因的phasiRNA的積累，并導致R基因的誘導表達，表明R基因-miRNA-phasiRNA調節(jié)模塊可以放大植物免疫反應。

7 SNC1蛋白水平的調控

翻譯后修飾（PTMs）是調節(jié)多種細胞功能所必需的。在大多數真核生物中，PTMs通過影響蛋白質的活性、穩(wěn)定性和定位來調節(jié)蛋白質功能。在植物防御信號途徑中，PTMs如磷酸化和泛素化起著重要作用。MOS5編碼擬南芥中兩種泛素激活酶（E1）中一種。[27]MOS5功能的丟失部分抑制snc1表型，導致R蛋白介導的防御活性受損。mos5突變體在泛素折疊結構域包含一個分子損傷，有可能破壞泛素化過程。mos5抑制了snc1的矮化表型，增強cpr1-2中觀察到的發(fā)育不良的生長形態(tài)。[28]MOS5作為泛素化途徑的重要組成部分，導致泛素結構被添加到目標蛋白中。[27]MOS8是ERA1的一個等位基因，編碼法尼基轉移酶。MOS8是異戊烯化所必需的[29]一種調節(jié)蛋白膜靶向性的PTMs。與其他ERA1等位基因一樣，mos8對P.s.m ES4326和H.a. Noco2的易感性增強，揭示法尼基化在基礎免疫中的作用。era1npr1雙突變體顯示增強的era1表型，表明ERA1在NPR1獨立通路中發(fā)揮作用。

8 展望

有關擬南芥SNC1基因的功能與結構已經有了較多的研究報道，但其在其他十字花科植物與其他物種中的有關研究還較少。有研究者將SNC1轉入棉花中，發(fā)現轉基因植株出現了明顯的免疫表型。油菜作為一種重要的經濟油料作物，與擬南芥同屬十字花科，但目前油菜SNC1基因的功能及其對植株免疫的調控作用仍不清楚。解析油菜中SNC1等R基因的生物學功能及其對油菜抗病性的調控機理，對于進一步利用油菜自身免疫提高其抗性，開發(fā)環(huán)境友好型防病措施從源頭上減少農藥的施用具有重要理論意義和實踐價值。

*通訊作者：夏石頭

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