關于多管發酵法測定糞大腸菌群的探討

王曉彤　孫義峰　汪進生

摘 要：目前，測定糞大腸菌群的標準方法有多管發酵法、濾膜法、酶底物法、紙片快速法。目前最常用的方法為多管發酵法。生態環境保護部發布的《HJ347.2-2018水質糞大腸菌群的測定多管發酵法》改進了《HJ/T347-2007水質糞大腸菌群的測定多管發酵法和濾膜法》標準的不足，完善了方法原理的表述，并明確給出了15管法和12管法的檢出限等。對于具體工作中的重點，本文做了詳細的介紹。

關鍵詞：糞大腸菌群;方法;測定

1 糞大腸菌群的定義

糞大腸菌群是總大腸菌群的一部分，其主要來源于人畜糞便。通過對糞大腸菌群的測定，可以了解水體受糞便污染的程度。它又稱耐熱大腸菌群（thermotolerant coliforms）。44.5℃培養 24 h，能發酵乳糖產酸產氣的需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。

2 多管發酵法測定大腸菌群的方法原理

將樣品加入含乳糖蛋白胨培養基的試管中，37℃初發酵富集培養，大腸菌群在培養基中生長繁殖分解乳糖產酸產氣，產生的酸使溴甲酚紫指示劑由紫色變為黃色，產生的氣體進入倒管中，指示產氣。44.5℃復發酵培養，培養基中的膽鹽三號可抑制革蘭氏陽性菌的生長，最后產氣的細菌確定為是糞大腸菌群。通過查 MPN 表，得出糞大腸菌群濃度值。

3 方法的檢出限

12管法為3MPN/L，15管法為20MPN/L。

4 干擾和消除

4.1 活性氯具有氧化性，能破壞微生物細胞內的酶活性，導致細胞死亡，可在樣品采集時加入硫代硫酸鈉溶液消除干擾。

4.2 重金屬離子具有細胞毒性，能破壞微生物細胞內的酶活性，導致細胞死亡，可在樣品采集時加入乙二胺四乙酸二鈉溶液消除干擾。

5 培養基保存

配制好的培養基避光、干燥保存，必要時在5℃±3℃冰箱中保存，通常瓶裝及試管裝培養基不超過3～6 個月。配制好的培養基要避免雜菌侵入和水分蒸發，當培養基顏色變化，或體積變化明顯時廢棄不用。

6 樣品采集

點位布設及采樣頻次按照GB/T 14581、HJ/T 494 和HJ/T 91 的相關規定執行。注意采集微生物樣品時，采樣瓶不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。清潔水體的采樣量不低于400 ml，其余水體采樣量不低于100 ml。采集河流、湖庫等地表水樣品時，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，約距水面10～15 cm 處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶內然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水中取出。如果沒有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的80%左右。樣品采集完畢后，迅速扎上無菌包裝紙。

從龍頭裝置采集樣品時，不要選用漏水龍頭，采水前將龍頭打開至最大，放水3～5 min，然后將龍頭關閉，用火焰灼燒約3 min 滅菌或用70%～75%的酒精對龍頭進行消毒，開足龍頭，再放水1 min，以充分除去水管中的滯留雜質。采樣時控制水流速度，小心接入瓶內。采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時，也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。在同一采樣點進行分層采樣時，應自上而下進行，以免不同層次的攪擾。

7 樣品保存

采樣后應在2 h 內檢測，否則，應10℃以下冷藏但不得超過6 h。實驗室接樣后，不能立即開展檢測的，將樣品于4℃以下冷藏并在2 h 內檢測。

8 試驗過程

8.1 初發酵試驗

將接種后的試管，在37℃±0.5℃下培養24 h±2 h。發酵試管顏色變黃為產酸，小玻璃倒管內有氣泡為產氣。產酸和產氣的試管表明試驗陽性。如在倒管內產氣不明顯，可輕拍試管，有小氣泡升起的為陽性。特別注意產氣不明顯的，要輕拍試管，不能視為陰性。

8.2 復發酵試驗

輕微振蕩在初發酵試驗中顯示為陽性或疑似陽性（只產酸未產氣）的試管，用經火焰灼燒滅菌并冷卻后的接種環將培養物分別轉接到裝有EC 培養基的試管中。在44.5℃±0.5℃下培養24 h±2 h。轉接后所有試管必須在30 min 內放進恒溫培養箱或水浴鍋中。培養后立即觀察，倒管中產氣證實為糞大腸菌群陽性。復發酵時，要特別注意接種后30min放進培養箱中，這個是新標準做的要求。

9 質量保證和質量控制

9.1 培養基檢驗

更換不同批次培養基時要進行陽性和陰性菌株檢驗，將糞大腸菌群的陽性菌株（如大腸埃希氏菌 Escherichia coli）和陰性菌株（如產氣腸桿菌 Enterobacter aerogenes）制成濃度為300～3000 MPN/L 的菌懸液。若使用的是定性標準菌株，配制方法為先進行預實驗，摸清濃度后按目標為300～3000 MPN/L 稀釋;若使用的是定量標準菌株，則可按照給定值直接稀釋。稀釋后分別取相應水量的菌懸液按接種的要求接種于試管中，然后按初發酵試驗和復發酵試驗要求培養，陽性菌株應呈現陽性反應，陰性菌株應呈現陰性反應。

9.2 空白對照

每次試驗都要用無菌水按照步驟進行實驗室空白測定。

9.3 陽性及陰性對照

定期按照8.1進行陽性及陰性對照試驗，陽性菌株應呈現陽性反應，陰性菌株應呈現陰性反應，否則，該次樣品測定結果無效，應查明原因后重新測定。

10 廢物處理

使用后的廢物及器皿須經 121℃高壓蒸汽滅菌30min或使用液體消毒劑（自制或市售）滅菌。滅菌后，器皿方可清洗，廢物作為一般廢物處置。

11 其他問題

在實際配置培養基的過程中，經過高溫滅菌后，培養液中的小倒管仍有氣泡的問題。通過經驗，發現70℃以下打開高溫滅菌鍋，可以減少氣泡的存在。如果時間允許，溫度越低越好。黎堯等對此做了詳細研究，作者發現在滅菌鍋內溫度下降到80℃及以上時開蓋，帶有氣泡的試管數量幾乎無變化;80℃～ 60℃開蓋，帶有氣泡的試管數量逐漸減少;60℃～ 40℃開蓋，帶有氣泡的試管數量明顯降低;40℃～ 25℃開蓋帶有氣泡的試管數量下降趨于穩定;待滅菌鍋內溫度冷卻至室溫時開蓋，氣泡去除率最高。同時，作者還做了無孔硅膠塞和有孔硅膠塞的對比，發現無孔硅膠塞更有利于氣泡的去除[1]。

參考文獻

[1]黎堯，張紹斌.多管發酵法測定水質糞大腸菌群的探討[J]環境與發展.2019（05）116-118