關(guān)于多管發(fā)酵法測(cè)定糞大腸菌群的探討

王曉彤　孫義峰　汪進(jìn)生

摘 要：目前，測(cè)定糞大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)方法有多管發(fā)酵法、濾膜法、酶底物法、紙片快速法。目前最常用的方法為多管發(fā)酵法。生態(tài)環(huán)境保護(hù)部發(fā)布的《HJ347.2-2018水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法》改進(jìn)了《HJ/T347-2007水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法和濾膜法》標(biāo)準(zhǔn)的不足，完善了方法原理的表述，并明確給出了15管法和12管法的檢出限等。對(duì)于具體工作中的重點(diǎn)，本文做了詳細(xì)的介紹。

關(guān)鍵詞：糞大腸菌群;方法;測(cè)定

1 糞大腸菌群的定義

糞大腸菌群是總大腸菌群的一部分，其主要來(lái)源于人畜糞便。通過(guò)對(duì)糞大腸菌群的測(cè)定，可以了解水體受糞便污染的程度。它又稱(chēng)耐熱大腸菌群（thermotolerant coliforms）。44.5℃培養(yǎng) 24 h，能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。

2 多管發(fā)酵法測(cè)定大腸菌群的方法原理

將樣品加入含乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，37℃初發(fā)酵富集培養(yǎng)，大腸菌群在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，產(chǎn)生的酸使溴甲酚紫指示劑由紫色變?yōu)辄S色，產(chǎn)生的氣體進(jìn)入倒管中，指示產(chǎn)氣。44.5℃復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的膽鹽三號(hào)可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，最后產(chǎn)氣的細(xì)菌確定為是糞大腸菌群。通過(guò)查 MPN 表，得出糞大腸菌群濃度值。

3 方法的檢出限

12管法為3MPN/L，15管法為20MPN/L。

4 干擾和消除

4.1 活性氯具有氧化性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集時(shí)加入硫代硫酸鈉溶液消除干擾。

4.2 重金屬離子具有細(xì)胞毒性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集時(shí)加入乙二胺四乙酸二鈉溶液消除干擾。

5 培養(yǎng)基保存

配制好的培養(yǎng)基避光、干燥保存，必要時(shí)在5℃±3℃冰箱中保存，通常瓶裝及試管裝培養(yǎng)基不超過(guò)3～6 個(gè)月。配制好的培養(yǎng)基要避免雜菌侵入和水分蒸發(fā)，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變化，或體積變化明顯時(shí)廢棄不用。

6 樣品采集

點(diǎn)位布設(shè)及采樣頻次按照GB/T 14581、HJ/T 494 和HJ/T 91 的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。注意采集微生物樣品時(shí)，采樣瓶不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。清潔水體的采樣量不低于400 ml，其余水體采樣量不低于100 ml。采集河流、湖庫(kù)等地表水樣品時(shí)，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，約距水面10～15 cm 處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶?jī)?nèi)然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水中取出。如果沒(méi)有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的80%左右。樣品采集完畢后，迅速扎上無(wú)菌包裝紙。

從龍頭裝置采集樣品時(shí)，不要選用漏水龍頭，采水前將龍頭打開(kāi)至最大，放水3～5 min，然后將龍頭關(guān)閉，用火焰灼燒約3 min 滅菌或用70%～75%的酒精對(duì)龍頭進(jìn)行消毒，開(kāi)足龍頭，再放水1 min，以充分除去水管中的滯留雜質(zhì)。采樣時(shí)控制水流速度，小心接入瓶?jī)?nèi)。采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時(shí)，也可使用滅菌過(guò)的專(zhuān)用采樣裝置采樣。在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí)，應(yīng)自上而下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾。

7 樣品保存

采樣后應(yīng)在2 h 內(nèi)檢測(cè)，否則，應(yīng)10℃以下冷藏但不得超過(guò)6 h。實(shí)驗(yàn)室接樣后，不能立即開(kāi)展檢測(cè)的，將樣品于4℃以下冷藏并在2 h 內(nèi)檢測(cè)。

8 試驗(yàn)過(guò)程

8.1 初發(fā)酵試驗(yàn)

將接種后的試管，在37℃±0.5℃下培養(yǎng)24 h±2 h。發(fā)酵試管顏色變黃為產(chǎn)酸，小玻璃倒管內(nèi)有氣泡為產(chǎn)氣。產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的試管表明試驗(yàn)陽(yáng)性。如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯，可輕拍試管，有小氣泡升起的為陽(yáng)性。特別注意產(chǎn)氣不明顯的，要輕拍試管，不能視為陰性。

8.2 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)

輕微振蕩在初發(fā)酵試驗(yàn)中顯示為陽(yáng)性或疑似陽(yáng)性（只產(chǎn)酸未產(chǎn)氣）的試管，用經(jīng)火焰灼燒滅菌并冷卻后的接種環(huán)將培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)接到裝有EC 培養(yǎng)基的試管中。在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24 h±2 h。轉(zhuǎn)接后所有試管必須在30 min 內(nèi)放進(jìn)恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋中。培養(yǎng)后立即觀察，倒管中產(chǎn)氣證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)性。復(fù)發(fā)酵時(shí)，要特別注意接種后30min放進(jìn)培養(yǎng)箱中，這個(gè)是新標(biāo)準(zhǔn)做的要求。

9 質(zhì)量保證和質(zhì)量控制

9.1 培養(yǎng)基檢驗(yàn)

更換不同批次培養(yǎng)基時(shí)要進(jìn)行陽(yáng)性和陰性菌株檢驗(yàn)，將糞大腸菌群的陽(yáng)性菌株（如大腸埃希氏菌 Escherichia coli）和陰性菌株（如產(chǎn)氣腸桿菌 Enterobacter aerogenes）制成濃度為300～3000 MPN/L 的菌懸液。若使用的是定性標(biāo)準(zhǔn)菌株，配制方法為先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸清濃度后按目標(biāo)為300～3000 MPN/L 稀釋;若使用的是定量標(biāo)準(zhǔn)菌株，則可按照給定值直接稀釋。稀釋后分別取相應(yīng)水量的菌懸液按接種的要求接種于試管中，然后按初發(fā)酵試驗(yàn)和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)要求培養(yǎng)，陽(yáng)性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。

9.2 空白對(duì)照

每次試驗(yàn)都要用無(wú)菌水按照步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白測(cè)定。

9.3 陽(yáng)性及陰性對(duì)照

定期按照8.1進(jìn)行陽(yáng)性及陰性對(duì)照試驗(yàn)，陽(yáng)性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無(wú)效，應(yīng)查明原因后重新測(cè)定。

10 廢物處理

使用后的廢物及器皿須經(jīng) 121℃高壓蒸汽滅菌30min或使用液體消毒劑（自制或市售）滅菌。滅菌后，器皿方可清洗，廢物作為一般廢物處置。

11 其他問(wèn)題

在實(shí)際配置培養(yǎng)基的過(guò)程中，經(jīng)過(guò)高溫滅菌后，培養(yǎng)液中的小倒管仍有氣泡的問(wèn)題。通過(guò)經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)70℃以下打開(kāi)高溫滅菌鍋，可以減少氣泡的存在。如果時(shí)間允許，溫度越低越好。黎堯等對(duì)此做了詳細(xì)研究，作者發(fā)現(xiàn)在滅菌鍋內(nèi)溫度下降到80℃及以上時(shí)開(kāi)蓋，帶有氣泡的試管數(shù)量幾乎無(wú)變化;80℃～ 60℃開(kāi)蓋，帶有氣泡的試管數(shù)量逐漸減少;60℃～ 40℃開(kāi)蓋，帶有氣泡的試管數(shù)量明顯降低;40℃～ 25℃開(kāi)蓋帶有氣泡的試管數(shù)量下降趨于穩(wěn)定;待滅菌鍋內(nèi)溫度冷卻至室溫時(shí)開(kāi)蓋，氣泡去除率最高。同時(shí)，作者還做了無(wú)孔硅膠塞和有孔硅膠塞的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)無(wú)孔硅膠塞更有利于氣泡的去除[1]。

參考文獻(xiàn)

[1]黎堯，張紹斌.多管發(fā)酵法測(cè)定水質(zhì)糞大腸菌群的探討[J]環(huán)境與發(fā)展.2019（05）116-118