肝胃百合湯對慢性應激與幽門螺桿菌雙重損傷因素模型小鼠胃黏膜組織HSP70、NF-κB蛋白表達的影響

喻斌　曾孟暉　徐寅　杜珊　黃柳向　毛一之　符佳

〔摘要〕 目的 觀察肝胃百合湯對慢性應激與Hp感染雙因素損傷模型小鼠胃組織NF-κB、HSP70蛋白表達的影響，并研究其治療機制。方法 將60只雄性小鼠隨機分為6組，分別為空白組、單純應激組、單純Hp組、Hp+應激組、肝胃百合湯組及雷尼替丁組;空白組和單純Hp組正常飼養，不限制進食進水;其余各組小鼠隨機選取禁食、禁水、電擊、行為束縛等10種刺激方法制備慢性應激小鼠模型。于造模第7天時，除空白組及單純應激組外，其余各組小鼠給予Hp菌液灌胃;連續造模14 d時，肝胃百合湯組小鼠灌胃肝胃百合湯，雷尼替丁組小鼠予以灌胃鹽酸雷尼替丁，其他各組小鼠灌胃蒸餾水;連續干預14 d后，取胃組織檢測潰瘍指數;采用免疫組化法檢測小鼠胃黏膜組織HSP70、NF-κB的蛋白表達。結果 對比空白組，單純Hp組、單純應激組以及Hp+應激組小鼠的潰瘍指數與HSP70、NF-κB蛋白表達明顯升高（P<0.01），且Hp+應激組小鼠的潰瘍指數及NF-κB蛋白表達顯著高于單純應激組及單純Hp組（P<0.01）;對比Hp+應激組，肝胃百合湯組和雷尼替丁組小鼠潰瘍指數均顯著降低（P<0.01），且肝胃百合湯小鼠的潰瘍指數組顯著低于雷尼替丁組（P<0.01）;肝胃百合湯組和雷尼替丁組HSP70蛋白表達顯著增加（P<0.01），NF-κB蛋白表達顯著降低（P<0.01），且肝胃百合湯組HSP70蛋白表達量大于雷尼替丁組，NF-κB蛋白表達量低于雷尼替丁組（P<0.01）。結論 慢性應激與Hp可協同致胃黏膜損傷;肝胃百合湯可能是通過使HSP70蛋白表達增加，加強胃組織的自身修復作用，使受體的自身免疫能力提高，并降低NF-κB蛋白表達，減少其活性，使受損胃組織的炎癥反應降低，從而起到抑制Hp，修復受損胃組織，加快胃潰瘍好轉的作用。

〔關鍵詞〕 肝胃百合湯;慢性應激性胃潰瘍;幽門螺桿菌;HSP70;NF-κB

〔中圖分類號〕R285.5;R573.1? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.09.005

Effects of Ganwei Baihe Decoction on Expressions of HSP70 and NF-κB Proteins in

Gastric Mucosa Tissue of Model Mice with Double Injury Factors of

Chronic Stress and Helicobacter pylori

YU Bin1， ZENG Menghui2， XU Yin1， DU Shan3， HUANG Liuxiang1， MAO Yizhi3， FU Jia1

（1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Xingsha Branch of Hunan Provincial People's Hospital/People's Hospital of Changsha County， Changsha，

Hunan 410100， China; 3. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Ganwei Baihe Decoction on expressions of HSP70 and NF-κB proteins in gastric mucosa tissue of model mice with double injury factors of chronic stress and Helicobacter pylori， and to study its mechanism of treatment. Methods A total of 60 male mice were randomly divided into 6 groups： blank group， stress group， Hp group， Hp + stress group， Ganwei Baihe Decoction group， and ranitidine group. The blank group and the Hp group were given normal diet， without limiting the intake of food and water; the other groups were randomly given 1 of the 10 stimulus methods such as fasting food， fasting water， electric shock， behavior constraints and other methods to prepare chronic stress mouse models. On the 7th day of modeling， except the blank group and the stress group， the other groups were given Hp bacterium solution by gavage. After 14 d of continuous modeling， the Ganwei Baihe Decoction group was given Ganwei Baihe Decoction by gavage， the ranitidine group was given ranitidine hydrochloride by gavage， and the rest groups were given distilled water by gavage. After 14 d of continuous intervention， gastric tissue was selected to determine ulcer indexes. The expressions of HSP70 and NF-κB proteins in gastric mucosa tissue of mice were detected by immunohistochemistry. Results The ulcer indexes and HSP70 and NF-κB protein expressions in the stress group， the Hp group and the Hp + stress group were significantly higher than those in the blank group （P<0.01）， and the ulcer index and NF-κB protein expression in the Hp + stress group were significantly higher than those in the stress group and the Hp group （P<0.01）. Compared with the Hp + stress group， the ulcer indexes in the Ganwei Baihe Decoction group and the ranitidine group were significantly decreased （P<0.01）， and the ulcer index in the Ganwei Baihe Decoction group was significantly lower than that in the ranitidine group （P<0.01）. The expression of HSP70 protein in the Ganwei Baihe Decoction group and the ranitidine group was significantly increased （P<0.01）， and the NF-κB decreased expression was significantly decreased （P<0.01）. And the expression quantity of HSP70 protein in the Ganwei Baihe Decoction group was higher than that in the ranitidine group， and the expression quantity of NF-κB protein was lower than that in the ranitidine group （P<0.01）. Conclusion Chronic stress and Hp can cause gastric mucosal injury in synergy. Ganwei Baihe Decoction can increase the expression of HSP70 protein， promote self-repair function of gastric tissue， enhance the immunity of receptors， decrease NF-κB protein expression and activity， and decrease the inflammatory reaction of gastric tissue， so as to achieve the effects of inhibiting Hp， repairing gastric mucosal injury， and promoting ulcer healing.

〔Keywords〕 Ganwei Baihe Decoction; chronic stress gastric ulcer; Helicobacter pylori; HSP70; NF-κB

胃潰瘍（gastric ulcer，GU）是指在飲食藥物刺激、精神應激、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori， Hp）感染等條件下，由于胃酸或胃蛋白酶自我消化破壞胃組織，而引起的潰瘍，其破壞程度通常達到或超過了胃黏膜肌層。而Hp也是潰瘍發生的重要原因之一。Matsushima等[1]通過調研發現，神戶大地震發生后的一段時間，消化性潰瘍的人群顯著增加，其中很大一部分患者都是由于精神壓力過大導致，同時Hp感染在胃潰瘍的發病中也有不可忽視的作用。根據調查結果，Yamamoto等[2]對應激與Hp感染雙重損傷因素對小鼠胃組織的損害作用進行了實驗研究，得出了Hp感染會使強迫游泳小鼠出現的胃黏膜破壞更加嚴重的結論。而Guo等[3]研究發現，感染了Hp的BALB/c小鼠，慢性心理應激會使其胃中Hp繁殖量明顯增加，并使Hp導致的胃組織損傷更加嚴重，證明慢性應激與Hp對胃黏膜的損傷有協同作用。

對于慢性應激引起并同時有Hp感染的消化性潰瘍患者，現代醫學一般選擇三聯或四聯療法來清除Hp、保護胃黏膜，此療法起效較快，可有容易耐藥、副作用較多、費用較高的不足之處，且胃中定植的Hp雖被清除，但慢性應激使患者產生的不適感并沒有太大緩解。肝胃百合湯是已故湖湘中醫五老之一的夏度衡教授的經驗方，也是夏教授“后天脾胃難離肝”的學術思想的代表方，本院使用此方治療合并有Hp感染的肝胃氣滯型胃潰瘍常有顯著療效。通過前期的各項研究[4-7]，得出了肝胃百合湯能明顯緩解肝胃氣滯型胃潰瘍患者的難受癥狀，對胃組織的修復有促進作用，且能有效殺滅Hp的結論。根據這個結論，我們進一步推測肝胃百合湯可能是通過加強熱休克蛋白70（heat shock protein 70， HSP70）的表達，降低核轉錄因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的活性來治療合并Hp感染的慢性應激性胃潰瘍。為中醫藥預防和治療合并Hp感染的慢性應激性胃潰瘍提出新的診療方法與實驗依據，現將實驗報道如下。

1 材料

1.1? 實驗動物和菌種

6周齡雄性健康BALB/c小鼠（SPF級）60只，質量在19～22 g之間，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SYXK（湘）2015-0003，動物質量合格號：43004700025541。動物飼養環境：溫度20～25 ℃，濕度50%～70%。幽門螺桿菌：悉尼標準菌株（悉尼菌株I，SSI），菌株含有空泡細胞毒素（vacA）和細胞毒素相關基因（cagA）蛋白由湖南中醫藥大學微生物免疫教研室提供，濃度為1×l09cfu/mL。

1.2? 實驗藥物

肝胃百合湯（百合15 g，柴胡9 g，郁金9 g，烏藥9 g，川楝子9 g，丹參9 g，白芍9 g，蒲公英15 g，甘草6 g），飲片購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房;煎煮飲片并使用離心機去除藥物中殘渣，將藥物濃縮至每1 mL含1 g生藥，置于4 ℃冰箱中備用。鹽酸雷尼替丁膠囊批號：1602224，購自佛山手心制藥有限公司，規格：0.15 g/粒。

1.3? 主要儀器及試劑

GIS-1000數碼凝膠圖像處理系統（天能科技有限公司），PM 8AD攝像顯微鏡（奧林巴斯公司），Image-Pro-Plus圖像分析軟件（Media Cybernetics）。PBS（pH 7.2～7.6）、枸櫞酸鹽緩沖液均購自Wellbio公司，HSP70一抗（批號10995-1-AP）、NF-κB一抗（批號14220-1-AP）均購自Proteintech公司。

2 方法

2.1? 實驗分組及造模方法

將60只BALB/C小鼠按體質量分層隨機分成6組，分別為空白組、單純應激組、單純Hp組、Hp+應激組、雷尼替丁組、肝胃百合湯組，每組10只?？瞻捉M及單純Hp組正常飼養，不限制飲水及納食。其他組按照相關文獻[8-9]隨機選取禁食、禁水、電擊、行為束縛等10種刺激方法制備慢性應激小鼠模型，固定于每天上午9時重新選擇刺激因素，共制造小鼠模型28 d。于造模第7天時，除空白組及單純應激組外，其余各組小鼠使用Hp菌液0.5 mL/只（1×109cfu/mL）灌胃，并在灌Hp菌液前24 h禁止進食，4 h禁止飲水;灌胃后再禁食禁水2 h。每次灌胃間隔1 d，共灌胃3次。28 d后，造模結束，剪斷小鼠尾巴提取血液檢測血清中Hp抗體，將小鼠胃組織制成病理切片，鏡下察看其炎癥情況。

2.2? 干預及樣本處理

小鼠連續造模14 d后，給予肝胃百合湯組小鼠灌胃肝胃百合湯，在灌胃前將藥物按照人體用藥量換算成小鼠等效劑量，換算后為12.2 g/（kg·d）。將鹽酸雷尼替丁膠囊用蒸餾水溶解后，按照60 kg成人用藥量換算成小鼠等效劑量40 mg/（kg·d），然后給雷尼替丁組小鼠灌胃;剩下各組小鼠給予同等體積（均為0.4 mL/d）蒸餾水灌胃。灌胃時間固定為每天更改刺激因素前1 h，連續灌胃14 d。2周灌胃結束后，將所有小鼠禁食禁水12 h，然后處死取出胃組織，從胃大彎測將胃組織剪開，把其中殘留物使用冰生理鹽水沖洗干凈，使用微測尺測量黏膜潰瘍或糜爛長度，計算潰瘍指數。選擇胃黏膜損傷較多的位置，取一塊約1 cm×0.5 cm的胃標本，用生理鹽水將其洗凈，放置于4%多聚甲醛中處理24 h后，切5 μm薄片，封片，用于免疫組化檢測。

2.3? 檢測指標及方法

2.3.1? 小鼠潰瘍指數及潰瘍抑制率 按照Guth標準測算胃黏膜潰瘍指數（ulcer index， UI）及潰瘍抑制率，使用微測尺測量胃組織中潰瘍或糜爛的長度（mm）：若糜爛為斑點狀計1分;糜爛不足1 mm則為2分;大于1 mm不足2 mm為3分;大于2 mm不足3 mm為4分;大于3 mm為5分;若同時寬度大于1 mm則分數翻倍，整個胃黏膜組織總分數即為潰瘍指數。

潰瘍抑制率=[（Hp+應激組平均潰瘍指數-藥物干預組平均潰瘍指數）/Hp+應激組平均潰瘍指數]×100%

2.3.2? 小鼠胃黏膜組織HE染色? 將所取胃黏膜使用石蠟包埋，然后切片脫蠟水洗，在蘇木素染液中浸泡染色2～4 min，水洗;置于1%鹽酸中分化約10 s，再使用流水沖洗5～l0 min，直至淡紫紅色的細胞核變為藍色，置于伊紅染液中浸染30 s，再分別使用60%～100%濃度乙醇脫水，使用二甲苯I、二甲苯II透明，中性樹膠封片，用光鏡觀察樣本。

2.3.3? 小鼠胃組織HSP70及NF-κB蛋白表達? 采用免疫組化法。按試劑盒說明書操作，制成封片后將樣本放于顯微鏡下觀測，并使用IPP圖像分析軟件分析觀測的圖像。在每個封片觀測到的圖像中，隨機選擇3個高倍視野，計算蛋白陽性表達面積占所選取區域總面積的百分比，作為HSP70、NF-κB的蛋白表達量，并進行半定量分析。

2.4? 統計學處理

數據使用SPSS 17.0軟件進行處理與分析，計量資料以“x±s”表示，用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行多組間比較。符合正態分布，同時方差齊性時，采用LSD法，方差不齊時采用Tamhane’s T2法，不符合正態分布采用非參數檢驗。P<0.05認為差異有統計學意義，P<0.01認為差異有顯著統計學意義。

3 結果

3.1? 小鼠治療后潰瘍指數及潰瘍抑制率比較

對比空白組，單純Hp組、單純應激組和Hp+應激組潰瘍指數明顯升高（P<0.01），同時Hp+應激組高于單純應激組及單純Hp組（P<0.01）;對比Hp+應激組，肝胃百合湯組和雷尼替丁組潰瘍指數明顯減?。≒<0.01），同時肝胃百合湯組潰瘍指數低于雷尼替丁組（P<0.01）。雷尼替丁組抑制潰瘍的百分比低于肝胃百合湯組。結果見表1。

3.2? 各組小鼠胃組織病理改變

空白組：胃組織光滑柔軟，未見到黏膜腫脹或紅斑，光鏡下可見胃黏膜細胞與腺體分布規整連續;單純Hp組：胃組織表面紅腫，不夠平整，有些許糜爛，腺體排列稍紛亂，光鏡下可觀察到浸潤的炎性細胞;單純應激組：胃組織黏膜層損壞，皺襞失去連續，能觀察到掉落壞死的細胞與被胃酸破壞的組織，并能看到部分胃黏膜糜爛和呈點線狀的潰瘍，光鏡下可見部分浸潤的炎性細胞;Hp+應激組：胃組織表面被破壞較嚴重，可見多處皺襞沒有連續性，有大量掉落的細胞、被破壞的組織以及出血，能見到許多糜爛的黏膜和點線狀的潰瘍損害，浸潤的炎性細胞比較多，胃黏膜肌層甚至都可見炎性細胞;肝胃百合湯組：胃組織的破壞明顯少于Hp+應激組，腺體分布規整連續，個別可見少許紅腫，可觀察到些許呈點狀的糜爛，黏膜未見潰瘍損害，光鏡下僅觀察到少許的炎癥反應;雷尼替丁組：胃黏膜較平滑，可見程度較輕的腫脹，腺體的分列尚連續，胃組織被破壞的地方均不深，有些許糜爛，未見到較顯眼的潰瘍，光鏡下能觀察的浸潤的炎性細胞。見圖1。

3.3? 各組小鼠胃組織免疫組化結果

黃褐色部分在免疫組織化學圖像中為陽性表現。在顯微鏡下可發現，空白組小鼠胃組織HSP70、NF-κB陽性區域較小;單純Hp組、單純應激組和Hp+應激組HSP70、NF-κB在圖像中陽性區域均顯著高于空白組，且Hp+應激組多于單純Hp組、單純應激組;肝胃百合湯組和雷尼替丁組均有大部分HSP70蛋白陽性表達，且陽性區域明顯大于Hp+應激組，其中肝胃百合湯組陽性表達高于雷尼替丁組;肝胃百合湯組和雷尼替丁組胃組織NF-κB在圖像中僅有少許陽性區域，遠低于Hp+應激組，且肝胃百合湯組NF-κB陽性表達低于雷尼替丁組。HSP70、NF-κB蛋白的表達分別見圖2和圖3。

3.4? 各組小鼠胃組織HSP70、NF-κB蛋白表達的比較

各組小鼠胃組織HSP70蛋白表達的比較：對比空白組，單純Hp組、單純應激組和Hp+應激組小鼠胃組織HSP70蛋白表達明顯升高（P<0.01），但是三組之間蛋白表達量的差異無統計學意義（P>0.05）;對比Hp+應激組，肝胃百合湯組及雷尼替丁組小鼠胃組織HSP70蛋白表達大幅升高（P<0.01），同時肝胃百合湯組高于雷尼替丁組（P<0.05），結果見表2。

各組小鼠胃組織NF-κB蛋白表達的比較：對比空白組，單純Hp組、單純應激組和Hp+應激組小鼠胃組織NF-κB蛋白表達明顯上升（P<0.01），同時Hp+應激組小鼠胃組織NF-κB蛋白表達量高于單純應激組及單純Hp組（P<0.05）;對比Hp+應激組，肝胃百合湯組和雷尼替丁組NF-κB明顯減少（P<0.01），且肝胃百合湯組少于雷尼替丁組（P<0.05），結果見表2。

4 討論

慢性應激性胃潰瘍可分于傳統醫學“胃脘痛”“胃瘍”的類別，疾病的發生經常是由先天體質欠佳、情緒意志失調、飲食饑飽無常、睡眠晝夜顛倒等引起;這些個人體質、生活習慣、情志調控的不足，使中州脾胃受損，不能很好起到人體氣機運行樞紐的職責，進而導致全身氣機混亂，升降失調。因此可認為疾病發生的機制是胃中氣血失于調和，全身氣機運行混亂。同時我們在臨床中觀察發現，合并有Hp感染的胃部疾病的患者常有口干苦、苔黃膩等濕熱性質的表現，而Hp有傳染性、病情容易反復、殺滅后仍有可能再次感染的致病特點，也類似于傳統醫學中濕熱之邪重濁黏滯等的致病特點。所以對于此類疾病的治療需以疏肝行氣、和胃止痛、清熱燥濕為原則。肝胃百合湯是已故的湖湘知名老中醫夏度衡教授個人創制方，夏度衡教授結合眾多古代醫學名家的傳世經典以及自己幾十年治病救人的體會，發表了“后天脾胃難離肝”的學術主張，并在為病人處方選藥的時候十分注意調節肝胃間相互的影響。肝氣質剛強，并有相火藏于其中，用藥治療肝時，切記不可一味地使用辛香發散的藥物來調暢肝氣，因為此類藥物會引起肝木更加亢盛，克制脾胃之土，使其氣陰損傷。肝胃百合湯此方正是根據夏度衡教授這個觀點而創制。方中選藥將疏肝行氣，活血止痛作為主要原則，同時輔以清熱、補虛，寒溫并調，補瀉同用，達到了調暢肝氣，恢復脾胃氣機升降樞紐職責的目的。

Hp是一類定植于人體胃組織的革蘭陰性微需氧桿菌，它是引起消化性潰瘍重要因素[10-11]，并且很大一部分消化性潰瘍都能通過清除Hp得到好轉甚至完全治愈[12];在經過大量醫學臨床觀察與動物實驗后，研究人員提出Hp與應激會相互協同損害胃組織，Hp還會進一步加重應激性胃潰瘍患者的病情[13]。HSP是一類在機體應激時能起到保護作用的蛋白質，它在胃組織的修復中尤為重要。正常情況下，HSP在細胞中的表達一直處于較低狀態，但當機體受到損傷而產生應激反應時，HSP將顯著增加其在細胞中的表達。這類蛋白質中，對胃組織起到最重要保護作用的是HSP70。NF-κB是一個功能眾多的轉錄調節因子，它與機體的炎癥反應、免疫應答等都有密切關系。當感染、創傷、氧氣缺乏等刺激機體使其處于應激狀態時，NF-κB被激活，開始調節許多與炎癥反應有關的細胞因子、黏附分子和蛋白酶類的基因轉錄，使機體出現炎癥反應。與此同時，相應的炎癥因子也會進一步使NF-κB的活性加強，NF-κB與炎癥因子相互催化相互放大，使炎癥對機體的傷害更加嚴重[14-15]。眾多研究者發現，Hp感染機體會促進NF-κB的活化，而HSP70可以維持細胞的生存和功能，提高細胞抵抗力，對Hp的預防和殺滅起到了十分重要的作用[16-17]。同時，HSP70與NF-κB也會相互競爭和對抗，HSP70能夠使NF-κB活化受到抑制，讓它與炎癥因子之間無法相互催化促進，有效加強了胃組織的自我修復能力并明顯改善了炎性反應對機體的損傷[18]。

通過實驗我們發現：慢性應激合并Hp感染對于小鼠胃組織的破壞性明顯高于單純慢性應激或單純Hp感染。經過肝胃百合湯和雷尼替丁干預后，Hp+應激模型小鼠的Hp定植量明顯減少，胃組織損傷情況顯著好轉，HSP70蛋白表達升高，NF-κB表達降低，且肝胃百合湯小鼠的潰瘍指數組顯著低于雷尼替丁組（P<0.01），HSP70蛋白表達明顯多于雷尼替丁組，NF-κB蛋白表達明顯少于雷尼替丁組（P<0.01）。說明肝胃百合湯可顯著減少慢性應激合并Hp感染胃潰瘍的炎性反應并能加快潰瘍的好轉，且效果優于西藥治療。

綜上所述，肝胃百合湯治療慢性應激合并Hp感染胃潰瘍的作用機制可能與使HSP70蛋白表達增加、抑制Hp、修復受損胃組織、提高機體自身免疫能力、抑制NF-κB活化、改善炎性反應對機體的損傷等方面有關。

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