白及PMM基因cDNA序列克隆及甘露糖合成相關基因的表達特性分析

許娟 石云平 蘇祖祥 林茜 李小泉 韋紹龍 桂杰 胡一鳳

摘要：【目的】克隆白及磷酸甘露糖變位酶（PMM）基因（BsPMM）cDNA序列，并檢測甘露糖合成相關基因的表達特性，為研究甘露糖合成相關基因的調控功能及白及多糖合成機制提供理論依據?！痉椒ā坎捎肦T-PCR克隆BsPMM基因cDNA序列，對其進行生物信息學分析，并采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測BsPMM和GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因（BsGMP）在不同品種（桂及1號和桂及2號）、生育期（苗期、生長旺期和成熟期）和組織（葉片、莖、假鱗莖和根）中的表達特性，同時測定不同生育期假鱗莖的多糖和甘露糖含量?！窘Y果】克隆獲得的BsPMM基因cDNA全長1062 bp，包含一個759 bp的開放閱讀框（ORF），編碼252個氨基酸，該基因編碼的蛋白BsPMM定位于細胞質，含一個從細胞內部到外部的跨膜螺旋區;不穩定系數為41.67，為不穩定蛋白;總平均疏水指數為-0.304，為親水性蛋白，含植物PMM蛋白特有的4個保守結構域，屬于HAD超家族成員。BsPMM蛋白與單子葉植物尤其是蘭科植物鐵皮石斛和蝴蝶蘭PMM蛋白的親緣關系較近，與罌粟、葡萄和蘆筍等雙子葉植物PMM的親緣關系較遠。BsPMM和BsGMP基因在不同品種、組織和生育期均有表達，且二者在假鱗莖中表達量顯著高于其他組織（P<0.05），區別在于桂及1號在生長旺期的表達量最高，而桂及2號在苗期的表達量最高。桂及1號和桂及2號假鱗莖中甘露糖含量和多糖含量均隨生育期推移呈逐漸升高的變化趨勢?！窘Y論】BsPMM和BsGMP基因表達具有時空、組織和品種特異性，可能是調控多糖合成代謝途徑中的關鍵基因，參與白及甘露糖和多糖的合成。

關鍵詞： 白及;甘露糖;多糖;磷酸甘露糖變位酶（PMM）;GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因（GMP）;表達特性

中圖分類號： S567.239? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A? ? ? ?文章編號：2095-1191（2019）09-1913-09

Abstract：【Objective】Phosphomannomutase（PMM） gene（BsPMM） cDNA sequence of Bletilla striata was cloned，the expression characters of Mannose synthesis related genes were determined. This would provide the theory basis for regulation functions of mannose synthesis related genes and synthesis mechanism of B. striata polysaccharides. 【Method】The cDNA sequence of BsPMM gene was cloned by RT-PCR， and its bioinformatic analysis was conducted. Real-time quantitative PCR（qPCR） was performed to detect the expressionof BsPMM and GDP-mannose pyrophosphorylase gene（BsGMP） in different species（Guiji No.1 and Guiji No.2）， growing stage（seeding stage， booming stage and maturing stage） and various tissues（leaf， stem， pseudobulb and root）. Meanwhile， the content of polysaccharide and mannose in pseudobulb was determined during growing stages. 【Result】The full length of BsPMM gene was 1062 bp，which contained 759 bp open reading frame（ORF） and encoded 252 amino acids. Its encoded protein BsPMM was distributed in cytoplasm with a transmembrane structures from the inside-out. Its instability index was 41.67 and therefore it was an unstable protein. The total average hydrophobic index was -0.304，so it was a hydrophilic protein with conserved domain shared by plant PMM proteins and it belong to HAD superfamily. The relationship between BsPMM protein and PMM protein of monocotyledon especially Orchidaceae such as Dendrobium officinale and butterfly orchid， and its relationship with dico-tyledon such as poppy， grape and asparagus. BsPMM and Bs GMP genes expressed in different varieties， tissues and growth stages， but their expressions in pseudobulb both were significantly higher than other tissues（P<0.05）， and the difference was that the expression of Guiji No.1 reached the peak at booming stage but that of Guiji No.2 reached the maximum at seeding stage. Meanwhile， the contents of polysaccharide and mannose in pseudobulb increased with growth time either in Guiji No.1 and Guiji No.2. 【Conclusion】The BsPMM and BsGMP genes expressed specifically in tissue， variety and during space and time， and maybe involve in the polysaccharide synthesis of B. striata as key genes in regulating polysaccharide synthesis and metabolism.

Key words： Bletilla striata; mannose; polysaccharide; phosphomannomutase（PMM）; GDP-mannose pyrophosphorylase gene（BsGMP）; expression characteristics

0 引言

【研究意義】白及多糖又稱白及膠，是從藥用植物白及[Bletilla striata（Thunb.） Reichb.f.]的假鱗莖中提取出的一種水溶性多糖，由多個單糖（甘露糖和葡萄糖）以糖苷鍵連接而成的聚合物（又稱甘露聚糖），分子量從幾萬至幾十萬不等（Kong et al.，2015），其作為一種高分子生物材料，在醫藥領域廣泛應用，如臨床上促進傷口愈合、抗菌、抗老化、抗腫瘤、抗纖維化等（Li et al.，2014;Posocco et al.，2015;孫愛靜等，2016;Zafar et al.，2016）。由于白及多糖的合成是由GDP-甘露糖開始，而磷酸甘露糖變位酶（PMM）和GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）是GDP-甘露糖合成的關鍵酶（Qian et al.，2007;Reiter，2008）。因此，從白及中克隆PMM和GMP基因，并對其進行生物信息學分析，揭示其基因結構、進化關系和時空表達特征等，對白及多糖合成途徑的遺傳改良及白及多糖含量提高具有重大意義?！厩叭搜芯窟M展】GDP-甘露糖是甘露糖的一種活化形式，直接為多糖的合成提供單糖，還可作為甘露糖供體參與到抗壞血酸、含甘露糖的多糖、細胞壁多糖及糖基化蛋白等生物合成過程中（Michel，2010;Lukowitz et al.，2001;Smirnoff et al.，2001）。目前，真菌、哺乳動物和植物均有研究獲得PMM。1959年Glaser等首次從酵母面包中分離獲得PMM，并發現該酶在體外也能催化甘露糖-6-磷酸與甘露糖-1-磷酸間的轉化。在植物中，最早從魔芋的球莖中分離獲得PMM（Murata，1976），而后相繼從西葫蘆（Hancock et al.，2003）、擬南芥（Hoeberichts et al.，2008）、煙草（Badejo et al.，2009）和霍山石斛（林榕燕等，2017）等植物中分離獲得PMM，其編碼基因也被成功克隆。此外，有研究發現，斑馬魚MM2基因缺乏會造成先天性糖基化紊亂從而導致其死亡（Cline et al.，2012）。擬南芥pmm-2突變體（溫度敏感型）在高溫條件下因無法合成GDP-甘露糖而引起蛋白糖基化紊亂導致細胞死亡（Hoeberichts et al.，2008）。將擬南芥PMM基因轉入煙草后過表達，煙草中的抗壞血酸含量增加（Badejo et al.，2009）。上述研究結果表明，PMM參與N-糖基化過程，可促進GDP-甘露糖合成并增加抗壞血酸的含量。【本研究切入點】目前，有關白及GDP-甘露糖合成研究相對滯后，僅許娟等（2018）克隆白及GMP基因并對其進行生物信息學分析，鮮見有關白及PMM基因cDNA序列克隆及甘露糖合成相關基因表達分析的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】克隆白及PMM基因（BsPMM）cDNA序列全長，對其進行生物信息學分析，并采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測甘露糖合成相關基因（BsPMM和BsGMP）在不同品種、生育期和組織中表達情況，為研究甘露糖合成相關基因的調控功能及白及多糖合成機制提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試白及品種為桂及1號和桂及2號，種植于廣西農業科學院生物技術研究所白及種植基地（南寧上林縣），均為組培苗移栽，移栽時間為2017年3月5日。主要試劑：RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒和QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix Kit購自寶生物工程（大連）有限公司;KOD FX高保真PCR酶購自東洋紡（上海）生物科技有限公司;其他生物試劑和引物合成均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1. 2 樣品采集

采集生長1年以上的白及植株新鮮葉片，用于BsPMM基因cDNA序列克隆。2018年分別于白及苗期（3月25日）、生長旺期（5月25日）和成熟期（倒苗期初始，9月25日）采集其葉片、莖、假鱗莖（塊莖）和根，每時期分別取兩個品種生長健壯植株各3株作為1個生物學重復，設3次重復，用于定量表達分析。取樣時用清水洗凈，紙巾吸干水分，再混勻樣株各組織，立即用液氮速凍，于-80 ℃保存備用。將不同生育期采集的假鱗莖用于多糖和甘露糖含量測定。

1. 3 引物設計

基因克隆和qRT-PCR所用引物（表1）由Primer 5和Oligo 6.0設計，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 4 BsPMM基因cDNA序列克隆

按照RNA提取試劑盒說明提取葉片總RNA，以其為模板，利用5'端錨定引物（表1），參照反轉錄試劑盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為50.0 μL：10×KOD Buffer 5.0 μL，2.0 mmol/L dNTPs 5.0 μL，10 μmol/L上、下游引物（PMM-F和PMM-R）（表1）各1.0 μL，1 U/μL KOD酶1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，25 mmol/L MgCl2 3.0 μL，用ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：98 ℃預變性30 s;98 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環;72 ℃延伸7 min。PCR產物加A尾反應：取PCR產物50.0 μL，加入2×Taq PCR Master Mix 50.0 μL，72 ℃下反應60 min。將加A尾的PCR產物經膠回收試劑盒純化回收，并與pUC57載體連接后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養基上培養12～16 h，篩選出陽性克隆，隨機挑取單菌落進行PCR鑒定（黃瓏等，2015），并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1. 5 生物信息學分析

基于BsPMM基因cDNA序列的測序結果，利用NCBI的ORF Finder在線工具查找分析其開放閱讀框（ORF）。利用BioXM 2.6和TMpred預測BsPMM蛋白的理化性質。利用Softberry和TMpred對BsPMM蛋白進行亞細胞定位和跨膜區預測，并利用SWISS-MODEL和RasMol 2.7.5進行三級結構預測及建模，運用NCBI的Conserved Domain Database（CDD）在線工具進行功能結構域分析，最后運用MEGA 5.0的近鄰相接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹。

1. 6 qRT-PCR檢測

參照QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix Kit說明配制定量反應體系，所用引物序列見表1，在熒光定量PCR儀ABI7500上進行qRT-PCR檢測。以Actin基因為內參，經內參基因標準化后再進行目的基因檢測。反應體系10.00 μL：2×SYBR Green PCR Master Mix 5.00 μL，QN ROX Reference Dye 0.05 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.70 μL，cDNA模板（≤100 ng）1.0 μL，用RNase-free水補足至10.00 μL。擴增程序：95 ℃預變性2 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環，最后分析熔解曲線。每個反應體系設3個重復。

1. 7 多糖和甘露糖含量的測定

多糖含量測定參照蒽酮—硫酸顯色法（李德旺等，2018）;甘露糖含量測定采用HPLC法測定（張寧南等，2017）。

1. 8 統計分析

采用2-ΔΔCt法（Livak and Schmittgen，2010）換算目的基因相對表達量，并利用Origin 8.0作圖。多糖和甘露糖含量利用Excel 2007進行統計整理作圖，并利用SPSS 11.0進行差異顯著性分析。

2 結果分析

2. 1 BsPMM基因cDNA序列克隆結果

以白及葉片總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，PCR擴增獲得約800 bp的單一條帶（圖1-A），與預期結果相符。PCR產物經加A尾后，通過膠回收、連接轉化及菌落PCR檢測后，挑取陽性克隆進行測序，結果顯示，PCR產物加A尾后的長度為1062 bp（圖1-B）。將該序列在NCBI上進行BLAST比對分析，結果發現，其與其他植物的PMM基因核苷酸序列同源性較高，尤其與鐵皮石斛PMM基因序列（KF195558.1）相似度達94%，表明該序列為白及PMM基因cDNA序列。

2. 2 生物信息學分析結果

2. 2. 1 BsPMM基因cDNA序列及其推導氨基酸序列分析 在NCBI的ORF Finder上查找BsPMM基因的ORF，結果發現該基因的ORF為759 bp，位于163～921 bp區間，編碼252個氨基酸（圖2），蛋白分子量為28.61 kD，理論等電點為5.92。TMpred預測結果顯示，該蛋白含一個從細胞內部到外部的跨膜螺旋區，位于第169～188位氨基酸，但無從細胞外到細胞內的跨膜螺旋區。預測結果還顯示，該蛋白不穩定系數為41.67，為不穩定蛋白;總平均疏水指數為-0.304，疏水性最高值（2.122）出現在第43位氨基酸處，親水性最高值（-2.956）出現在第143位氨基酸處，推測該蛋白為親水性蛋白。亞細胞定位分析結果表明，BsPMM蛋白主要定位于細胞質中。功能結構域分析結果顯示，BsPMM蛋白屬于HAD超家族成員（圖3）。

2. 2. 2 BsPMM蛋白三級結構預測結果 利用SWISS-MODEL和RasMol 2.7.5對BsPMM蛋白的三級結構進行預測及建模，結果如圖4所示。BsPMM蛋白主要結構元件為α-螺旋、β-折疊和β-轉角（卷曲），分別含有24個典型的α-螺旋、26個β-折疊和52個β-轉角。

2. 2. 3 BsPMM蛋白同源性比對及進化分析 將BsPMM蛋白氨基酸序列提交至NCBI上進行BLAST同源性比對分析，結果發現，BsPMM蛋白的氨基酸序列與鐵皮石斛（Dendrobium officinale）PMM蛋白的同源性最高，達94%。利用DNANAN對7種植物PMM蛋白的氨基酸序列進行多重比對分析，結果如圖5所示。不同植物的PMM蛋白氨基酸序列具有較高的同源性，在84%以上，且BsPMM蛋白的功能域氨基酸種類與其他植物大致相同，均含植物PMM蛋白特有的4個保守結構域，即DVDGTLT的區域Ⅰ、VGGSD的區域Ⅱ、DKTY的區域Ⅲ和GGND的區域Ⅳ。這4個保守結構域與PMM的催化作用密切相關。

利用MEGA 5.0構建不同物種PMM蛋白的系統發育進化樹，結果如圖6所示。不同物種PMM蛋白主要聚成兩大分支（Ⅰ和Ⅱ）。Ⅰ分支中，BsPMM蛋白與蘭科植物鐵皮石斛（D. officinale）和蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）PMM蛋白最先聚在一起，表明三者親緣關系較近，再與蘭科植物深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica）、棕櫚科植物油棕（Elaeis guineensis）和海棗（Phoenix dactylifera）的PMM蛋白聚在一起。Ⅱ分支又可分為2個小分支，其中玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、小米（Setaria italica）和野生稻（Oryza bachyantha）等單子葉植物為一個小分支，罌粟（Macleaya cordate）、葡萄（Vitis vini-fera）、蘆筍（Asparagus officinalis）和胡楊（Populus euphratica）等雙子葉植物為另一個小分支。綜上所述，BsPMM蛋白與單子葉植物尤其是蘭科植物PMM蛋白的親緣關系較近，與雙子葉植物PMM蛋白的親緣關系較遠。

2. 3 BsPMM和BsGMP基因表達情況的檢測結果

2. 3. 1 BsPMM基因的表達情況 從圖7-A可知，在桂及1號中，苗期BsPMM基因在葉片、莖、假鱗莖和根中表達量無顯著差異（P>0.05，下同）;生長旺期BsPMM基因在假鱗莖中表達量顯著高于其他組織的表達量（P<0.05，下同）;成熟期BsPMM基因在假鱗莖中的表達量顯著高于根中的表達量，且二者均顯著高于葉片和莖中的表達量?？梢?，BsPMM基因表達具有組織特異性，參與調控白及生長發育機制，且由于假鱗莖為多糖儲藏部位，推測BsPMM基因參與白及多糖的合成。從圖7-A還可知，在同一組織中，不同生育期（苗期、生長旺期和成熟期）BsPMM基因表達量的變化趨勢不同，其中，BsPMM基因在葉片和莖部中的表達量均隨生育期推移呈降低的變化趨勢，即在苗期表達量最高;在假鱗莖中呈先升高后降低的變化趨勢，即在生長旺期表達量最高;而在根中呈先降低后升高的變化趨勢，即在成熟期表達量最高。

由圖7-B可知，BsPMM基因在桂及2號的表達規律與桂及1號存在異同，即均在假鱗莖表達量最高，區別在于其在桂及2號苗期的表達量最高，且在根中以生長旺期的表達量最高，表明BsPMM基因表達具有組織、時空和品種特異性。

2. 3. 2 BsGMP基因的表達情況 由圖8-A可知，在桂及1號中，苗期BsGMP基因在葉片、莖、假鱗莖和根中表達量也無顯著差異，且BsGMP基因在不同生育期的葉片和莖中的表達規律與BsPMM基因相似，均隨生育期推移其表達量呈降低趨勢，即在苗期表達量最高;同樣，BsGMP基因在假鱗莖中表達量也較高，尤其是生長旺期，顯著高于其他組織。可見，BsGMP基因為特異性表達，參與調控白及生長發育機制。

由圖8-B可知，桂及2號中BsGMP基因的表達規律與BsPMM基因相似，與桂及1號BsGMP基因的表達規律存在異同：在兩個品種中BsGMP和BsPMM基因均在假鱗莖表達量最高，區別在于桂及2號中BsGMP基因在苗期各組織（除葉片外）的表達量較高，表明BsGMP基因表達存在品種間差異。

綜上所述，BsPMM和BsGMP基因均具有組織和時空表達特異性，存在品種間差異，且在多糖儲藏部位（假鱗莖）表達量較高，推測BsPMM和BsGMP基因均參與白及多糖生物合成。

2. 4 桂及1號和桂及2號假鱗莖中多糖和甘露糖含量比較

由圖9可知，桂及2號的多糖含量隨生育期推移呈顯著升高變化趨勢，桂及1號的多糖含量也隨生育期推移呈逐漸升高的變化趨勢，但苗期與生長旺期無顯著差異。從圖10可知，桂及1號和桂及2號假鱗莖中甘露糖含量的變化趨勢與多糖含量的變化趨勢相同，均隨生育期推移呈逐漸升高的變化趨勢，但苗期與生長旺期無顯著差異，生長旺期與成熟期差異顯著。比較圖9和圖10可知，整個生育期內，桂及1號假鱗莖多糖含量和甘露糖含量均高于桂及2號。綜上所述，桂及1號和桂及2號在生長過程中甘露糖和多糖的積累量逐漸增加，且不同品種間存在明顯差異。

3 討論

本研究克隆獲得的BsPMM基因cDNA序列全長1062 bp，包含一個759 bp的ORF，編碼252個氨基酸，該蛋白與蘭科植物鐵皮石斛和蝴蝶蘭同源性較高，在90%以上，與海棗、油棕和深圳擬蘭等植物PMM蛋白的同源性較高，在84%以上，證明不同植物PMM蛋白的氨基酸序列具有高度的保守性，推測其在不同植物中發揮相似生理功能。此外，本研究通過BsPMM蛋白的理化性質和結構域分析結果顯示，該蛋白為親水性蛋白，屬于HAD超家族成員，與林榕燕等（2017）對霍山石斛PMM蛋白的研究結論相似。前人研究表明，HAD超家族是一個巨大的蛋白家族（Schmidberger et al.，2007），參與磷酸甘露糖、磷酸酯和鹵代物等合成代謝途徑。BsPMM蛋白含植物PMM蛋白特有的4個保守結構域，其是HAD超家族極保守的基序，可參與Asp親核試劑對底物磷酸基團的定向并與Mg2+結合（Seifried et al.，2013）。

本研究還發現，BsPMM和BsGMP基因在不同品種、組織和生育期均有表達，且二者在假鱗莖中表達量顯著高于其他組織，區別在于桂及1號在生長旺期的表達量最高，而桂及2號在苗期的表達量最高，表明兩個基因的表達具有時空、品種和組織特異性。由于假鱗莖是白及多糖的儲藏部位，推測BsPMM和BsGMP基因與白及多糖和甘露糖合成密切相關。前人研究表明，PMM基因參與抗壞血酸（Qian et al.，2007;何春梅，2015;高利芬等，2016）和巖藻聚糖（張朋艷等，2016）的合成，同時提高多糖含量并參與脅迫反應（He et al.，2017）。GMP基因除了具有上述生物學功能外，還參與甘露聚糖的合成（Davis et al.，2010）。本研究發現，BsPMM和BsGMP基因在桂及2號苗期假鱗莖中表達量最高，推測BsPMM和BsGMP基因不僅參與白及多糖生物合成，還可能參與其他物質的合成。另外，BsGMP基因在桂及1號成熟期根中的表達量也較高，該時期假鱗莖中多糖和甘露糖含量最高。由于在白及成熟期，地上部分葉片已經衰老，地下部分組織將甘露糖轉化為多糖，將多糖轉移到根部組織，推測BsGMP基因與多糖轉運密切相關。這與鐵皮石斛中PMM和GMP基因表達模式和多糖累積規律（何春梅，2015;俞振明，2017）一致。綜上所述，BsPMM和BsGMP基因可能參與白及多糖的合成。在今后的研究中，可通過RNAi干擾技術或過表達技術深入研究BsPMM和BsGMP基因對多糖生物合成的分子調控機理。

4 結論

BsPMM和BsGMP基因表達具有時空、組織和品種特異性，可能是調控多糖合成代謝途徑中的關鍵基因，參與白及甘露糖和多糖的合成。

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（責任編輯 陳 燕）