生防菌XP1對香蕉枯萎病防效及土壤細菌群落多樣性的影響

馬鳳娟 孫杰 徐培智 解開治 李夏 顧文杰 盧鈺升 徐如玉

摘要：【目的】研究生防菌解淀粉芽孢種菌XP1對香蕉根際土壤細菌群落多樣性的影響，揭示生防菌防治香蕉枯萎病的土壤微生物學機制，為利用生防菌防控香蕉枯萎病提供理論參考。【方法】試驗設3個處理：CK，健康蕉園+每株0.5 L滅菌PDA培養基灌根+每株0.5 L滅菌LB培養基灌根;DI，健康蕉園+香蕉枯萎病菌（菌液濃度1×109個/mL，接種量0.5 L/株）+每株0.5 L滅菌LB培養基;TR，健康蕉園+香蕉枯萎病菌（菌液濃度1×109個/mL，接種量0.5 L/株）+生防菌（菌液濃度1×109個/mL，接種量0.5 L/株）。利用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺，對3個處理香蕉植株的根際土壤分別提取總DNA并構建16S rDNA基因文庫，進而對微生物群落多樣性進行分析。【結果】生防菌XP1對香蕉枯萎病的防效試驗結果顯示，CK處理香蕉植株無發病現象;DI處理在接種香蕉枯萎病菌后蕉園的發病率達95.0%，病情指數為68.3;TR處理接種生防菌后蕉園的發病率為13.3%，病情指數降低至10.8，防治效果達84.2%。共測序獲得886890個有效序列，在97%的相似水平下聚類后獲得61660個OTUs，歸屬于40個細菌門。3個處理的OTUs數量表現為CK>DI>TR。變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、OD1、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）是3個處理共有的菌門，其中變形菌門是CK、DI和TR處理的優勢菌門，分別占各自相對豐度≥1%物種的32.21%、28.94%和53.78%。TR處理的Shannon指數和Simpson指數均顯著低于CK和DI處理（P<0.05，下同），Dominance指數顯著大于CK和DI處理，Chao1指數和Observed species指數大于DI處理、小于CK處理;接種生防菌后，TR處理的Chao1指數和Observed species指數較DI處理分別提高7.3%和0.7%。【結論】接種生防菌XP1能有效防控大田香蕉枯萎病的發生，提高香蕉根際土壤細菌物種豐富度和有益菌比例，促進根際土壤細菌群落結構特征向健康土壤細菌群落結構特征的方向演替，具有一定的應用潛力。

關鍵詞： 香蕉枯萎病;根際土壤;生防菌;高通量測序;微生物多樣性

中國分類號： S436.681;S476? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A? ? ? ?文章編號：2095-1191（2019）09-1981-09

Abstract：【Objective】The study was conducted to reveal the effects of Bacillus amyloliquefaciens XP1 on the diversity of bacterial communities in rhizosphere soil of banana tree， show the soil microbiological mechanism of biocontrol agents and provide theoretical basis for biological control of banana fusarium wilt. 【Method】Three treatments were set up in this study：CK， healthy banana orchard+0.5 L sterilized PDA medium irrigating root per plant+0.5 L sterilized LB me-dium irrigating root per plant;DI， healthy banana orchard+banana fusarium wilt strain（bacterial solution concentration was 1×109/mL， inoculation amount was 0.5 L/plant）+0.5 L per plant sterilized LB medium;TR， healthy banana orchard+banana fusarium wilt strain（bacterial solution concentration was 1×109 /mL， inoculation amount was 0.5 L/plant） and biocontrol agent（bacterial solution concentration was 1×109 /mL， inoculation amount was 0.5 L/plant）. Using Illumina Hiseq 2500 high-throughput sequencing platform， total DNA was extracted from the rhizosphere soil of three banana plants treatments and 16S rDNA gene library was constructed to analyze the diversity of microbial communities. 【Result】The control test of XP1 on banana fusarium wilt indicated that there was no diseased banana plants in CK treatment， the incidence of banana orchard in DI treatment after inoculation of banana fusarium wilt fungus was 95.0% with disease index of 68.3. The incidence of banana orchard in TR treatment was 13.3% with disease index of 10.8， and the control effect was 84.2%. A total of 886890 valid sequences were obtained by sequencing， and 61660 OTUs（operational taxonomic unit） belonging to 40 phyla were obtained by clustering at 97% similarity level. The number of OTUs of the three treatments were in the following order：CK>DI>TR. Among them， Proteobacteria， Acidobacteria， Planctomycetes， Chloroflexi， Gemmatimonadetes， OD1， Nitrospirae， Firmicutes， Bacteroidetes， Actinobacteria and Verrucomrobia were the shared bacteria in three treatments. Among them， the dominant bacteria in CK， DI and TR were Proteobacteria， accounting for 32.21%， 28.94% and 53.78% of the species with relative abundance? irrigating root per plant 1%. The Shannon index and Simpson index of TR treatment were significantly lower than those of CK and DI treatments（P<0.05， the same below）， dominance index was significantly higher than that of CK and DI treatment， Chao1 index and Observed species index of TR treatment were larger than those of DI treatment and less than those of CK treatment. After biocontrol agent inoculation， the Chao 1 index and the Observed species index of TR treatment increased by 7.3% and 0.7%， respectively compared with DI treatment. 【Conclusion】The inoculation of XP1 can effectively prevent the occurrence of banana fusarium wilt in the field， improve the bacterial species richness in rhizosphere soil and proportion of beneficial bacteria， and promote the rhizosphere soil bacterial community succession towards direction of that in healthy soil. Therefore， it has potential in application.

Key words： banana fusarium wilt; rhizosphere soil; biocontrol agent; high-throughput sequencing; microbial diversity

0 引言

【研究意義】香蕉作為熱帶和亞熱帶水果在人們的日常生活中扮演著重要角色。近年來，隨著香蕉枯萎病的不斷加劇和蔓延，已給我國乃至全球香蕉產業帶來了重創（肖愛萍和游春平，2005）。香蕉枯萎病是一種極具破壞性的土傳病害，其發病過程為尖孢鐮刀菌侵染香蕉維管束，維管束腐爛壞死，香蕉枯萎死亡（聶燕芳等，2017）。香蕉枯萎病于1967年首次出現在我國臺灣省，隨后從廣東蔓延至福建，并迅速擴展到海南、廣西、云南等其他香蕉種植區（鄧鐵軍等，2015;周維等，2017），嚴重威脅我國香蕉種植業的發展。目前應對香蕉枯萎病的主要措施有化學防治、物理防治、培育抗病品種、生物防治及田間綜合管理等，其中，生物防治措施憑借其對環境污染小、安全程度高、能提高香蕉產量和品質等優點而越來越受到研究者們的重視（丁文娟等，2014;賴朝圓等，2018）。研究發現，土壤細菌的群落結構與香蕉發病率和產量顯著相關（Garbeva et al.，2004;Raaijmakers et al.，2009; Zhang et al.，2011;Phili-ppot et al.，2013;Wang et al.，2016），因此，研究土壤細菌群落的多樣性對維持土壤健康和抑制植物病害具有重要意義。【前人研究進展】黃珍等（2010）對海南省福山香蕉園香蕉枯萎病發生地和正常種植園的土壤樣品進行研究，發現正常香蕉種植區土壤樣品的細菌多樣性較豐富，其中變形菌門、厚壁菌門和酸桿菌門為主要細菌類群，而香蕉枯萎病發生地土壤以放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）為主要細菌類群。付琳等（2012）研究發現，通過生物有機肥處理后微生物群落結構變得更加優化，可提高香蕉抵抗病原菌的能力。鄧曉等（2015）在對香蕉健康植株和患病植株根際細菌群落多樣性的比較中發現，患病植株根際的細菌多樣性小于健康植株根際的細菌多樣性。鐘書堂等（2015）發現連續兩年施用生物有機肥可明顯降低尖孢鐮刀菌數量，使蕉園土壤可培養微生物群落結構更加均衡，實現對香蕉枯萎病的防效提升和產量及果實品質的提高。Shen等（2015）通過連續兩年施用微生物肥料發現，土壤細菌多樣性和微生物群落結構得到優化，從而降低了香蕉枯萎病的發病率。【本研究切入點】目前，針對香蕉枯萎病的研究主要集中在患病蕉園和健康蕉園土壤微生物群落多樣性的差異上，對在患病蕉園施入生防菌劑后土壤細菌群落的變化特征研究甚少。【擬解決的關鍵問題】采用大田區組試驗，利用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺，研究生防菌XP1接種土壤后對香蕉根際土壤細菌群落多樣性的影響，探索生防菌防治香蕉枯萎病的土壤微生物學機制，以期為利用生防菌劑防控香蕉枯萎病提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗地概況

試驗地位于廣東省湛江市徐聞縣邁陳鎮那種基地（東經110°10′17.90″，北緯20°19′39.90″），氣候類型為熱帶季風氣候，年平均氣溫23.5 ℃，年平均降水量1364 mm。試驗區為連續8年種植韭菜的平整地塊，土壤類型為磚紅壤，土壤理化性質為有機質14.4 g/kg、堿解氮62.3 mg/kg、有效磷（P2O5）38.0 mg/kg、速效鉀（K2O）108.6 mg/kg、pH 5.6。

1. 2 試驗材料

供試香蕉品種：巴西蕉（Cavendish，cv. Brazilium AAA，香蕉枯萎病感病品種）組培苗。供試病原菌：帶有標記綠色熒光蛋白的香蕉枯萎病菌4號生理小種（簡寫GFP-FOC4），由廣東省農業科學院果樹研究所李春雨博士饋贈，致病性與野生型菌株一致。供試生防菌：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）XP1，由廣東省農業科學院農業資源與環境研究所提供。XP1培養條件：利用PDA和LB混合培養基在28 ℃的培養箱中連續培養5 d，抑菌圈直徑為62.5 mm（孫杰，2018）;PDA和LB混合培養基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖（C6H12O6·H2O）20 g、胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1000 mL。

主要試劑：MOBIO PowerSoil? DNA Isolation Kit試劑盒（貨號12888-100）購自北京寶杰羅生物科技有限公司（MOBIO）;Premix Taq（E×Taq Version 2.0 Plus）（貨號RR902A）、DL15000 DNA Marker（貨號3582A）、100 bp DNA Ladder（貨號3422A）和DL2000 DNA Marker（貨號3247A）購自寶日醫生物技術（北京）有限公司（TaKaRa）;Primer（訂購合成）和Quant-iTTM Broad-Range DNA Assay（貨號Q32853）購自美國英杰生命技術有限公司（Invitrogen）;瓊脂糖（貨號111860）購自廣州浩瑪生物科技有限公司。主要儀器：PCR擴增儀（型號 ABI9600，美國）和Daek reader（型號DR-46B）購自Clare Chemical Research;QubitTM Fluorometer（型號Qubit? 2.0 Fluorometer）購自Invitrogen公司;微型離心機（型號Baygene BG-Qspin#8482）購自Baygene;渦旋混合器（型號QL-901）購自其林貝爾儀器制造有限公司;凝膠成像儀（型號Tanon 4100）購自上海天能科技有限公司。

1. 3 試驗方法

1. 3. 1 試驗設計 試驗設3個處理，每處理3次重復，隨機區組排列，共9個小區，小區面積223 m2。其中，CK：健康蕉園+每株0.5 L滅菌PDA培養基灌根+每株0.5 L滅菌LB培養基灌根;DI：健康蕉園+香蕉枯萎病菌（菌液濃度1×109個/mL，接種量0.5 L/株）+每株0.5 L滅菌LB培養基;TR：健康蕉園+香蕉枯萎病菌（菌液濃度1×109個/mL，接種量0.5 L/株）+生防菌（菌液濃度1×109個/mL，接種量0.5 L/株）。

香蕉枯萎病菌采用灌根法在香蕉7～8片葉、株高40～50 cm時接種。TR處理生防菌劑是在香蕉枯萎病菌接種后24 h灌根。香蕉種植密度為60株/223 m2，起壟種植，株行距1.5 m×2.5 m。

1. 3. 2 根際土壤采集方法 土壤樣品于DI處理小區95%香蕉植株出現發病癥狀時進行采集（約移栽后100 d）。參照Zhao等（2016）的根際土壤采集方法，在每小區按發病重度、中度、輕度各采取4株完整植株根際土壤。將采集的根際土壤混合均勻，分成兩份，一份約2000 g室溫保存，用于土壤理化性質測定;一份約500 g放入無菌密封袋裝入冰盒，帶回實驗室-80 ℃保存，用于細菌群落多樣性分析。

1. 3. 3 理化性質測定方法 土壤pH采用pH計、全磷采用鉬銻抗比色法、全氮采用半微量凱氏定氮法、堿解氮采用堿解擴散法進行測定（鮑士旦，1999）;土壤速效磷和速效鉀分別采用碳酸氫鈉浸提鉬銻抗比色法和乙酸銨浸提火焰光度法進行測定（張甘霖和龔子同，2012）;硝態氮和銨態氮采用流動注射分析法進行測定。

1. 3. 4 防效調查 參照張志紅等（2008）的方法將香蕉枯萎病發病情況分為5個等級：0級，植株無枯黃癥狀;1級，植株下部葉片出現輕微的枯黃癥狀，嫩葉完好，少部分根系輕微褐變，莖部出現水漬狀褐變;2級，植株下部葉片出現明顯的枯黃癥狀，但嫩葉完好，根系出現褐變，莖部和假莖部出現水漬狀褐變;3級，整株植株出現枯黃癥狀，根系褐變腐爛，莖部和假莖部褐變連片，少數葉柄出現紅褐;4級，植株出現枯萎死亡癥狀，根系嚴重褐變腐爛。收獲期調查香蕉枯萎病發病率和病情指數，參考Xu等（2004）的方法統計香蕉發病率、病情指數和防治效果。

發病率（%）=發病的植株數/處理植株總數×100

病情指數=∑各級發病數×該級代表數/總數×最高級代表值×100

防病效果（%） =（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100

1. 3. 5 土壤總DNA提取 采用土壤DNA提取試劑盒（MOBIO PowerSoil? DNA Isolation Kit）對土壤樣品進行總DNA提取，每個土樣設置3個重復，最后把提取的所有DNA混合成一個樣品。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。

1. 3. 6 擴增及產物電泳檢測 采用通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACNVGGGTWTCTAA-3'）對細菌16S rDNA高變區V4區進行目標片段擴增。PCR反應體系50 μL：2×PCR Mix 25 μL，20 ng/μL DNA模板3 μL，10 mmol/L正、反向引物各1 μL，ddH2O 20 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共進行30個循環;72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。每個樣品3個重復，擴增完成后將同一樣本的PCR產物進行混合。PCR產物電泳檢測：用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的片段長度和濃度，篩選出主帶長度在正常范圍內（16S V4：290～310 bp）的樣品。

1. 3. 7 Pooling及切膠純化 按照等質量原則，利用GeneTools Analysis Software（Version 4.03.05.0，SynGene）計算各樣品PCR產物所需體積后進行混合，并使用EZNA Gel Extraction Kit（OMEGA，USA）凝膠回收試劑盒回收目標片段。

1. 3. 8 建庫及測序 按照NEBNext? UltraTM DNA Library Prep Kit for Illumina?（New England Biolabs，USA）標準操作流程進行建庫，并對研究構建的擴增子文庫采用 Illumina Hiseq 2500平臺進行PE250測序。

1. 3. 9 數據處理 分別利用Mothur（Schloss et al.，2009）、Flash（Mago? and Salzberg，2011）和Trimmomatic（Bolger et al.，2014）對測序數據進行質量控制及過濾，得到有效的拼接片段（Clean Tags）。

1. 3. 10 序列處理與分析 利用Usearch以97%的默認相似性將序列聚類成為一個OTU（Operational taxonomic units），再與NCBI數據庫進行比對及物種注釋。

（1）菌群豐富度（Species richness）指數計算方法（只考慮物種數量）：

a. Chao1-the Chao1 estimator：用Chao1算法估計樣本中所含OTU數目的指數（Liu et al.，2014）。

Schao1=Sobs+[n1（n1+1）2（n2+1）]

其中，Schao1：估計的OTU數目;Sobs：實際觀測到的OTU數目;n1：只含有一條序列的OTU數目（singletons）;n2：只含有兩條序列的OTU數目（doubletons），以此類推。

b. Observed species：指樣本中實際測定得到的OTU數目，可間接反映樣品中物種的豐富程度（Chaparro et al.，2014）。

（2）菌群多樣性（Species diversity）指數計算方法：

a. Dominance指數：表示隨機取兩條序列，來自同一個物種的概率。

Ddominance=[p2i]

其中，pi代表OTU（i）在全部OTU中的比例。Dominance 也可定義為1-Simpson’s index。其值在0～1之間。

b. Shannon指數：香農—維納指數（Shannon-Wiener index）（Yates et al.，2012），用來估算樣本中微生物多樣性指數之一，值越大說明群落多樣性越高。

Hshannon=[-i=1SobsniNlnniN]

其中，Sobs：實際測量出的OTU數目;ni：含有i條序列的OTU數目;N：所有序列數。

c. Simpson指數：辛普森指數（Simpson’s diversity index）（Liu et al.，2014）用來估算樣品中微生物的多樣性指數之一，Simpson 指數值越大，說明群落多樣性越高。

Dsimpson=1-[i=1Sobsnini-1NN-1]

其中，Sobs：實際觀測到的OTU數目;ni：含有i條序列的OTU數目;N：所有序列數。

1. 4 統計分析

試驗數據采用 Excel 2016進行整理并制圖，采用IBM SPAS Statistics 22.0進行統計分析。使用R軟件進行Venn圖繪制和Alpha多樣性指數組間差異分析;基于OTU相對豐度，利用QIIME軟件包中的Alpha-rarefaction腳本進行Observed-species指數稀釋曲線數據計算，然后利用R軟件繪制稀釋曲線;基于3種Beta多樣性距離矩陣，使用qiime2和ggplot2軟件包進行PCoA分析并繪圖。基于均一化的OTU豐度，使用R軟件vegan包的anosim函數進行Anosim分析。

2 結果與分析

2. 1 生防菌XP1對香蕉枯萎病的防治效果

由表1可知，CK處理香蕉植株無發病現象;DI處理在接種香蕉枯萎病菌GFP-FOC4后蕉園的發病率高達95.0%，病情指數為68.3;TR處理接種生防菌XP1后蕉園的發病率為13.3%，與DI處理相比差異達極顯著水平（P<0.01，下同），病情指數降低至10.8，防治效果顯著，達84.2%。TR處理香蕉枯萎病發病率較DI處理降低81.7%（絕對值），說明生防菌對香蕉枯萎病菌具有較強的拮抗作用。

2. 2 Observed species指數分析結果

共測序獲得886890個序列，在97%的相似水平下聚類后獲得61660個OTUs。測序結果顯示，3個樣品的所有優質序列經聚類注釋后歸屬于40個菌門。從圖1可看出，當測序深度達80000個序列時，各處理的Observed species指數曲線趨向平緩，上升速度減緩，說明測序深度已基本覆蓋樣品中絕大部分物種;在同等測序深度上，無發病現象的CK處理實際觀測到的物種數最多，當測序深度達70000個序列時，接種致病菌的DI處理實際觀察到的物種數低于CK處理、高于TR處理，隨測序深度的加大，接種生防菌的TR處理其實際觀測到的物種數略高于DI處理、低于CK處理。

2. 3 OTU聚類分析結果

由圖2可看出，CK、DI和TR處理分別有8163、7039和6944個OTUs，其中，CK與DI處理共有4596個OTUs，CK與TR處理共有5546個OTUs，DI與TR處理共有4190個OTUs。三者的OTUs數量表現為CK>DI>TR，說明CK處理中的微生物種類最豐富，DI次之，TR處理中的微生物種類最少。由各處理間共有的OTUs數量可知，CK與TR處理的共有物種種類較多，DI與TR處理共有的物種種類最少，說明TR處理經過生防菌作用后細菌群落內部的物種種類與無發病狀況的健康土壤物種種類更接近。

2. 4 Alpha多樣性指數分析結果

為保證各處理在同一測序深度，所有序列進行均一化處理后所得的Alpha多樣性參數如下表2所示。由表2可知，DI處理除Dominance指數略大于CK處理外，Chao1指數、Observed species指數、Simpson指數和Shannon指數分別比CK小869.6、817、0.001和0.375，表明GFP-FOC4在根際定殖后降低了土壤細菌群落的多樣性和豐度。TR處理的Dominance指數顯著大于DI和CK處理，說明TR處理細菌物種的分布較DI和CK處理更集中;TR處理的Shannon指數和Simpson指數均顯著低于CK和DI處理，說明TR處理的細菌群落多樣性和群落均勻性小于CK和DI處理;TR處理的Chao1指數和Observed species指數大于DI處理、小于CK處理，說明TR處理中實際觀察到的細菌物種數量大于DI處理、小于CK處理。接種生防菌后，TR處理的Chao1指數和Observed species指數與DI處理相比分別提高7.3%和0.7%，香蕉根際土壤中的細菌物種豐度得到有效提高。

2. 5 門水平上細菌群落結構組成分析結果

各樣品相對豐度≥1%的菌門組成情況見圖3。由圖3可知，變形菌門（Proteobacteria）是CK、DI和TR處理的優勢菌門，分別占各自相對豐度≥1%物種的32.21%、28.94%和53.78%，且TR與CK和DI處理間達顯著差異水平（P<0.05，下同）;酸桿菌門（Acidobacteria）在CK、DI和TR處理中的比重有依次減少的趨勢;擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和放線菌門（Actinobacteria）在DI處理中的比重最大，在TR處理中的比重最小;硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和OD1等在CK處理中的比重均略大于其他兩個處理。綜上，蕉園發病后降低了硝化螺旋菌門、變形菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、OD1和浮霉菌門的豐度，接種生防菌后變形菌門、綠彎菌門、OD1和硝化螺旋菌門的相對豐度有回升趨勢;發病后增加了厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和疣微菌門的豐度，生防菌劑處理后上述菌門的相對豐度均有所下降;變形菌門、厚壁菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、放線菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門、OD1、硝化螺旋菌門和疣微菌門是3個處理共有的菌門種類。

2. 6 細菌群落結構與根際土壤環境因子的冗余分析（RDA）結果

利用細菌群落特征和土壤因子數據矩陣進行冗余分析可綜合反映土壤因子與細菌群落間的關系及相關程度。圖4中軸1和軸2分別解釋了細菌群落構成與環境變量間關系的84.23%和14.33%，兩軸共解釋了98.56%，較好地解釋了細菌群落特征與根際土壤理化性質間的關系。從圖4可看出，變形菌門與pH間呈正相關，與其他理化指標間呈負相關;酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、OD1、浮霉菌門、硝化螺旋菌門、疣微菌門與全磷（Total phosphorus）含量、速效磷（Available phosphorus）含量、速效鉀（Avai-lable potassium）含量、全氮（Total nitrogen）含量、堿解氮（Alkaline nitrogen）含量間呈正相關，與pH、銨態氮（Ammonium nitrogen）含量、硝態氮（Nitrate nitrogen）含量間呈負相關;厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門與銨態氮含量、硝態氮含量間呈正相關，與其他理化指標間呈負相關。

2. 7 樣品組間主坐標分析結果

從基于加權的主坐標分析結果（圖5）可看出，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）是造成3組樣品差異的兩個最大特征，貢獻率分別為67.02%和27.05%，兩者共解釋了細菌群落結構差異的94.07%。CK與DI處理在PC2軸上相距較遠，說明致病菌FOC4-GFP施入土壤后改變了土壤細菌群落結構;DI與TR處理在PC1軸上相距較遠，說明接入致病菌FOC4-GFP再施入生防菌XP1后，改變了土壤細菌群落結構;CK與TR處理在PC1和PC2軸上均有一定距離，說明TR與CK處理間細菌群落構成差異明顯。各處理重復間相距較近，處理間距離較遠，說明各處理內部間群落結構相似性較高，各處理間群落結構差異明顯。

2. 8 組間群落結構差異顯著性分析結果

從Anosim相似性分析結果（表3）可知，3個處理間的R為1，說明CK、DI和TR處理組間差異大于組內差異，與PCoA分析結果一致，且統計分析的可信度P為0.003，小于0.05，表明統計具有較高的可信度。

3 討論

近年來，由于連作、施肥不當和線蟲危害等導致的土傳病害越來越普遍，給農業生產帶來重大經濟損失。研究發現，土傳病害的發生主要與土壤微生物群落結構失衡、生態環境惡化等有關（van Bruggen and Semenov，2000）。生物防治是目前用于防控香蕉枯萎病最受歡迎的一種綠色安全措施，其原理是利用生防菌來抑制病原菌的繁殖和增長，從而使土壤微生物生態系統維持均衡。

本研究的試驗地是8年連作韭菜地，韭菜殘留物含有的2-甲基-2-戊烯醛、2-甲基-3-硫醚和2-丙基-3-硫醚等成分可有效抑制田間香蕉枯萎病的發生（王彤，2018）。本研究發現未接種病原菌GFP-FOC4和生防菌XP1的CK處理大田無香蕉植株發病現象;接入病原菌后，香蕉枯萎病的發病率高達95.0%，說明尖孢鐮刀菌已入侵到香蕉植株體內，導致香蕉維管束壞死;接種生防菌解淀粉芽孢桿菌后，香蕉枯萎病發病率由95.0%下降到13.3%，防效極顯著。究其原因：一是解淀粉芽孢桿菌作為一種生防菌，在其生長過程中能產生多種抑菌物質，具有廣泛抑制真菌的功能（Yuan et al.，2013）;二是一些土傳植物病原菌通常是從宿主根部的傷口或在初生根和次生根的交界處開始入侵，而生防菌對這些根際重要生態位點的占領可有效防止病原菌對植物根系的侵襲（Compant et al.，2005;Timmusk et al.，2005;Zhou et al.，2018）。

已有大量研究報道土傳病害會引起作物根際土壤中微生物多樣性和均勻性降低。Gorissen等（2004）在對馬鈴薯青枯病的研究中發現，馬鈴薯患病后其植株根際土壤細菌多樣性明顯小于健康植株根際土壤。鄧曉等（2015）比較了香蕉健康植株與患病植株根際細菌群落的多樣性，發現患病植株根際細菌多樣性小于健康植株根際的細菌多樣性。肖蓉等（2017）通過高通量測序比較患炭疽病草莓與健康草莓根際土壤細菌群落多樣性，發現發病草莓根際土壤的細菌群落豐富度和多樣性均小于健康植株根際土壤。本研究中，DI處理的Chao1指數、Observed species指數、Shannon指數和Simpson指數均小于CK處理，說明植株發病后其根際土壤細菌多樣性和豐富度均較健康植株根際土壤有所減少;健康植株根際土壤（CK）有更豐富的微生物群落構成，且微生物多樣性和豐富度均較高;在接種病原菌的基礎上接入生防菌的TR處理，其Chao1指數和Observed species指數較DI處理均有所提高，說明接入生防菌后可增加土壤中細菌的豐富度，很大程度上能阻控物種豐富度不斷減小的趨勢。

本研究對細菌群落組成的分析發現，變形菌門、厚壁菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、放線菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門、OD1、硝化螺旋菌門和疣微菌門是3個處理共有的11個菌門，變形菌門、酸桿菌門和厚壁菌門是3個處理共有的優勢菌門，其中變形菌門在TR處理中所占的比重最高，為53.78%。也有研究表明，變形菌門中有很多對植物生長有益的細菌，其存在與增殖對土壤能量平衡起重要作用（翟婉璐等，2017）。因此，本研究中盡管接種生防菌的TR處理Simpson指數和Shannon指數并未提高，但細菌群落結構變得更加優化。李冬麗等（2011）對海南省臨寶縣南寶鎮健康土樣和香蕉枯萎病發病程度高達80%的土樣進行分析，發現兩種土樣均以厚壁菌門、酸桿菌門、變形菌門、黃桿菌門、綠灣菌門和螺旋菌門為主要類群。鄧曉等（2015）通過對海南香蕉枯萎病患病植株根際和健康植株根際土壤微生物群落特征進行分析，發現健康植株和發病植株根際土壤的優勢菌門均為厚壁菌門，分別高達64%和75%。本研究結果與李冬麗等（2011）、鄧曉等（2015）的研究結果基本一致，但本研究識別的菌門種類更多、分類更詳細，且優勢菌門種群與李冬麗等（2011）、鄧曉等（2015）的研究結果有所不同，推測是土壤樣品來源和自然環境不同所致。

PCoA分析結果表明，CK和TR處理的細菌群落結構相似性大于DI和TR處理，說明患病蕉園施用解淀粉芽孢桿菌XP1后，細菌群落結構逐漸向健康土壤的方向演替，其原因是生防菌改善了微生物菌群間的相互關系。Saravanan等（2004）研究發現，在香蕉根際接種熒光假單孢菌后，熒光假單孢菌大量定殖，進而取代了病原真菌的生態位，成為根際優勢菌群，聯合根際拮抗菌代謝物質共同抑制病原菌的生長。冗余分析結果顯示，軸1和軸2共解釋了98.56%的群落差異性，說明所選理化指標能較好地分析微生物群落結構與環境因子間的相關性。牛世全等（2017）研究發現，pH與擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門呈正相關;速效鉀含量與綠彎菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門、酸桿菌門和疣微菌門成正相關。本研究結果與之大致相同，不同的是銨態氮和硝態氮含量分別與擬桿菌門和厚壁菌門呈正相關。本研究中，酸桿菌門與土壤全氮和堿解氮含量呈正相關，與Magill和Aber（2000）對森林土壤研究得出的土壤中氮含量的增加會使酸桿菌門的多樣性增加相符合。

4 結論

患病蕉園接種生防菌XP1后，XP1能在香蕉根際土壤中定殖和增殖，并通過改善香蕉根際土壤細菌群落結構特征，提升細菌群落物種豐富度和有益菌比例，有效阻控病原菌在香蕉根際的定殖和增殖，使香蕉枯萎病發病率顯著降低，具有一定的應用潛力。

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（責任編輯 麻小燕）