除草活性成團泛菌ZLSY20菌株發酵條件的優化

吳志美 蘭明先 高熹 李夢月 袁遠 郭子俊 殷興華 吳國星

摘要：【目的】明確除草活性成團泛菌ZLSY20菌株的最佳發酵條件，為應用成團泛菌對紫莖澤蘭進行生物防治打下基礎。【方法】采用單因素試驗，對一株來自澤蘭實蠅幼蟲消化道的成團泛菌ZLSY20菌株進行基礎發酵培養基[YSP培養基、營養瓊脂培養基（NA）、LB培養基、細菌基本培養基（CM）、NYBD培養基和紫莖澤蘭瓊脂培養基（EAS）]和發酵條件（溫度16～40 ℃、初始pH 4～9、接菌量0.05%～2.50%、通氣量20～160 mL/250 mL、發酵時間0～72 h、轉速140～240 r/min）篩選， 并用正交試驗對培養基組分及培養條件進行優化。【結果】ZLSY20菌株在YSP培養基上生長最快，細菌濃度最大;在葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉和甘露醇6種不同碳源中，蔗糖最有利于ZLSY20菌株生長;在甘氨酸、蛋白胨、硝酸銨、胰蛋白胨和谷氨酸作氮源時，蛋白胨最有利于ZLSY20菌株生長，其次為胰蛋白胨;YSP培養基中蛋白胨1.5%、酵母膏2.0%和蔗糖2.0%時ZLSY20菌株生長最快。在不同的發酵條件下，以發酵時間24 h、培養溫度32 ℃、pH 8、接菌量0.05%、通氣量20 mL/250 mL、轉速200 r/min的菌株生長最好。【結論】優化方案下可有效提高ZLSY20菌株的發酵產量，建立的方案可用于快速、大批量地發酵ZLSY20菌懸液。

關鍵詞： 紫莖澤蘭;成團泛菌;ZLSY20菌株;發酵條件

中圖分類號： S476.11? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）09-1990-08

Abstract：【Objective】The optimum fermentation conditions of Pantoea agglomerans ZLSY20 strain were clarified， which laid a foundation for the biological control of the Eupatorium adenophorum Spreng by using P. agglomerans. 【Me-thod】A single factor experiment was used to optimize the fermentation conditions of a P. agglomerans strain ZLSY20 from the digestive tract of the Procecidochares utilis larvae. The experiments included different media[YSP media， nu-trient agar media（NA）， LB media， bacterial basal media（CM）， NYBD media and Ageratina adenophoraagar media（EAS）]， fermentation conditions（temperature16-40 ℃， initial pH 4-9， inoculation quantity 0.05%-2.50%， ventilation volume 20-160 mL/250 mL， fermentation time 0-72 h， rotational speed 140-240 r/min）. Orthogonal test was used to optimize the media components and culture conditions. 【Result】Strain ZLSY20 grew the fastest on YSP media with the lar-gest bacteria concentration. Among the six carbon sources（glucose， sucrose， maltose， lactose， starch and mannitol）， sucrose was the most favorable to the growth of ZLSY20. When glycine， peptone， ammonium nitrate， tryptone and glutamic acid were used as nitrogen sources， peptone was the best for the growth of strain ZLSY20， followed by tryptone. In YSP media， when peptone was 1.5%， yeast cream 2.0% and sucrose 2.0%， the growth of ZLSY20 strain was the fastest. Under different fermentation conditions， when fermentation time was 24 h， temperature was 32 ℃， pH=8， inoculation amount was 0.05%， ventilation volume was 20-160 mL/250 mL， rotational speed was 200 r/min， the strain ZLSY20 grew the best. 【Conclusion】The optimized fermentation conditions can effectively increase the fermentation yield of ZLSY20 strain， which can be applied in rapid and large-scale fermentation of ZLSY20 bacterial suspension.

Key words： Eupatorium adenophorum Spreng; Pantoea agglomerans; ZLSY20 strain; fermentation conditions

0 引言

【研究意義】紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum Spreng）隸屬于菊科澤蘭屬，是一種入侵性極強的多年生惡性雜草。紫莖澤蘭于20世紀40年代經中緬邊境傳入我國，因其生命力強、繁殖快而迅速蔓延至四川、貴州和西藏等地。紫莖澤蘭可破壞生態系統，影響土壤理化性質，嚴重阻礙入侵地農林牧業的發展，是我國外來入侵物種中危害最嚴重的植物之一（楊國慶等，2008;王翀等，2014;蘭明先等，2017）。澤蘭實蠅是紫莖澤蘭的重要專食性天敵，可有效控制紫莖澤蘭的蔓延（魯武峰等，2018）。本課題組前期研究發現，從澤蘭實蠅幼蟲腸道分離獲得的成團泛菌ZLSY20菌株具有一定的除草活性，對紫莖澤蘭葉片具有侵害作用（蘭明先等，2018），因此，明確除草活性成團泛菌ZLSY20菌株的最佳發酵條件，可為成團泛菌應用于紫莖澤蘭的生物防治提供依據。【前人研究進展】目前，人們對控制入侵植物紫莖澤蘭的危害有防治和利用兩種思路，一方面是試圖將紫莖澤蘭變廢為寶以減少侵害，但尚未成熟;另一方面，對防除紫莖澤蘭進行大量研究，包括機械防除、化學防除、生物防治和替代控制等（歐國騰等，2012;李霞霞等，2017;朱文達等，2018），但對紫莖澤蘭發生嚴重的區域，如單純采用機械或化學方法防治效果并不理想，且成本高、污染重（朱文達等，2013;王亞麒等，2016）。利用澤蘭實蠅控制紫莖澤蘭是生物防治的一項重要措施。張某等（2016）采用16S rDNA基因文庫技術和Illumina Hi Seq測序技術檢測自然種群澤蘭實蠅幼蟲腸道內的細菌，發現細菌多樣性豐富，但未作進一步的活性研究。【本研究切入點】本課題組前期研究從澤蘭實蠅幼蟲中分離純化得到22株共生菌，且發現有6株菌（分別屬于芽孢桿菌屬和泛菌屬等）對紫莖澤蘭葉片有侵害作用（蘭明先等，2018），目前僅初步進行了澤蘭實蠅幼蟲共生細菌的活性探究，尚缺乏詳細的發酵條件研究。【擬解決的關鍵問題】采用單因素試驗和正交設計試驗，對1株來自澤蘭實蠅幼蟲消化道的成團泛菌ZLSY20菌株的基礎發酵培養基和發酵條件（溫度、初始pH、接種量、通氣量、發酵時間、轉速）進行優化，明確其最佳發酵條件，為利用細菌防治紫莖澤蘭打下一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試菌種 成團泛菌屬（Pantoea agglome-rans）ZLSY20菌株為本課題組前期分離所得，系澤蘭實蠅幼蟲內生細菌，保存于云南農業大學昆蟲毒理學實驗室。

1. 1. 2 供試培養基 營養瓊脂培養基（NA）：牛肉膏0.60 g，蛋白胨2.00 g，NaCl 1.00 g，瓊脂18.00 g，水200 mL;121 ℃滅菌20 min。LB培養基：蛋白胨2.00 g，酵母提取物1.00 g，氯化鈉2.00 g，瓊脂3.00 g，蒸餾水200 mL;121 ℃滅菌20 min。細菌基礎培養基（CM）：葡萄糖1.00 g，（NH4）2SO4 0.40 g，檸檬酸鈉0.20 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，K2HPO4 0.80 g，KH2PO4 1.20 g，瓊脂3.00 g，蒸餾水200 mL;121 ℃滅菌20 min。NYBD培養基：牛肉浸膏1.60 g，酵母浸粉1.00 g，葡萄糖2.00 g，蒸餾水200 mL;121 ℃滅菌20 min。YSP培養基：蛋白胨2.00 g，酵母膏1.00 g，蔗糖4.00 g，蒸餾水200 mL;121 ℃滅菌20 min。紫莖澤蘭瓊脂培養基（EAS）：選取幼嫩的紫莖澤蘭莖、葉、花等50 g，洗凈，加水200 mL，在勻漿機中搗碎10 min，煮沸30 min，用4層紗布過濾，將濾液定容至200 mL，加入瓊脂3.00～4.00 g;121 ℃滅菌20 min。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 培養基對細菌生長速度的影響 分別向含有100 mL YSP、NA、NYBD、CM、EAS和LB培養基的250 mL三角瓶中加入50 μL ZLSY20菌懸液，于220 r/min的搖床中25 ℃下分別振蕩培養24、48和72 h，采用分光光度法測定菌液在600 nm波長處的OD，以確定菌液濃度（高偉等，2009）。

1. 2. 2 培養基組分優化

1. 2. 2. 1 不同碳源對細菌生長速度的影響 以1.2.1中篩選出的適宜ZLSY20菌株生長的培養基為基礎培養基，分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉和甘露醇作碳源，配制不同發酵培養基進行ZLSY20菌株發酵培養，24 h后分別測定不同碳源培養基下菌液在600 nm波長處的OD，比較不同碳源對細菌生長速度的影響，確定最佳碳源（高偉等，2009）。

1. 2. 2. 2 不同氮源對細菌生長速度的影響 以1.2.1中篩選出的適宜ZLSY20菌株生長的培養基為基礎培養基，分別加入甘氨酸、蛋白胨、硝酸銨、胰蛋白胨和谷氨酸作氮源，配制不同發酵培養基進行ZLSY20菌株發酵培養，24 h后分別測定不同氮源培養基下菌液在600 nm波長處的OD，比較不同氮源對細菌生長速度的影響（高偉等，2009），確定最佳氮源。

1. 2. 2. 3 碳、氮源最佳濃度單因素試驗 分別將1.2.2.1和1.2.2.2篩選出的最佳碳、氮源設置不同濃度（碳源質量濃度分別為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%），氮源質量濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%），配制成不同濃度的發酵液進行ZLSY20菌株發酵培養。試驗重復3次，測定發酵液在600 nm波長處的OD（陳哲等，2016）。

1. 2. 2. 4 培養基濃度正交試驗 采用L9（33）對碳、氮源濃度的組合進行優化。試驗重復3次，測定發酵液的OD（陳哲等，2016）。

1. 2. 3 發酵條件優化

1. 2. 3. 1 溫度對細菌生長速度的影響 在優化培養基組分的基礎上，將ZLSY20菌株接種于最佳培養基中，在不同的溫度條件下（16、20、24、28、32、36和40 ℃）置于轉速為220 r/min的搖床中培養，24 h后測定各溫度下菌液在600 nm波長處的OD，從而判斷溫度對細菌生長速度的影響（張根偉，2005）。

1. 2. 3. 2 初始pH對細菌生長速度的影響 制備優化的培養基，調節初始pH分別為 4、5、6、7、8和9，將ZLSY20菌株接種于不同pH的培養基中，置于轉速為220 r/min的搖床中培養，24 h后測定不同pH條件下菌液在600 nm波長處的OD，以此判斷pH對細菌生長速度的影響（張根偉，2005）。

1. 2. 3. 3 發酵時間對細菌生長速度的影響 制備優化的培養基，采用上述優化的溫度和pH，分別發酵0、12、24、36、48、60和72 h，測定不同發酵時間對ZLSY20菌株生長速度的影響（高偉等，2009）。

1. 2. 3. 4 時間、溫度和pH正交試驗 按優化的培養基組分配制培養液，分別選擇3個水平進行試驗，篩選ZLSY20菌株的最佳發酵時間、溫度和pH（陳哲等，2016）。

1. 2. 3. 5 初始接菌量對細菌生長速度的影響 將經搖床培養24 h的ZLSY20菌懸液按100 mL裝液量的0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%和2.50%分別接入優化培養基中，測定在不同接菌量條件下菌液在600 nm波長處的OD，測定不同初始接菌量對ZLSY20菌株生長速度的影響（張根偉，2005）。

1. 2. 3. 6 通氣量對細菌生長速度的影響 在250 mL三角瓶中分別放入優化發酵培養基20、40、80、120和160 mL，在220 r/min的搖床中培養24 h后測定不同通氣量下菌液在600 nm波長處的OD（張根偉，2005）。

1. 2. 3. 7 轉速對細菌生長速度的影響 將ZLSY20菌株接種到優化培養基中，培養條件采用1.2.3.4中的優化條件，設搖床轉速分別為140、160、180、200、220和240 r/min，測定不同轉速下菌液在600 nm波長處的OD（張根偉，2005）。

1. 2. 3. 8 接菌量、通氣量、轉速正交試驗 按優化的培養基組分配制培養液，分別選擇3個水平進行試驗，篩選ZLSY20菌株的最佳接菌量、通氣量和轉速（陳哲等，2016）。

1. 3 細菌生長曲線測定

按最優方案配制發酵液，并在最適發酵條件下進行發酵培養，在0～24 h內每隔2 h測一次OD，24 h后每隔12 h測一次OD，并制作生長曲線圖。

1. 4 統計分析

運用SPSS 18.0對試驗數據進行統計及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 培養基對細菌生長速度的影響

由圖1可看出，ZLSY20菌株在不同培養基上的生長速度存在差異，其中在YSP培養基上生長最快，細菌濃度最大，OD為2.35，其次為NA和LB培養基;ZLSY20菌株在EAS培養基上生長最慢，且顯著慢于除CM外的其他培養基處理（P<0.05，下同），表明該菌不適宜在EAS培養基上生長。

2. 2 培養基優化結果

2. 2. 1 碳源對ZLSY20菌株生長速度的影響 由圖2可知，ZLSY20菌株在以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉和甘露醇為碳源的培養基上其生長速度存在一定差異，但總體上差異不明顯，其中以蔗糖為碳源時細菌的濃度最大，OD為1.82。

2. 2. 2 氮源對ZLSY20菌株生長速度的影響 由圖3可知，ZLSY20菌株在以甘氨酸、谷氨酸、硝酸銨、蛋白胨、胰蛋白胨和酵母膏為氮源的培養基上其生長速度存在明顯差異，其中在蛋白胨和胰蛋白胨上的生長速度較快，細菌濃度較大，OD分別為2.29和2.28，均顯著高于其他氮源處理。

2. 2. 3 碳源和氮源濃度單因素試驗結果 由圖4～圖6可知，蔗糖采用2.0%、3.0%和4.0% 3個水平，酵母膏采用1.0%、1.5%和2.0% 3個水平，蛋白胨采用0.5%、1.0%和1.5% 3個水平進行正交試驗較合理。

2. 2. 4 碳、氮源濃度正交試驗結果 碳、氮源濃度正交試驗結果（表1）顯示，RA>RB>RC，即氮源蛋白胨（A）對細菌總數的影響最大，其次為酵母膏（B）和蔗糖（C），表明蛋白胨（A）含量變化對ZLSY20菌株生長速度的影響最大，而蔗糖（C）含量變化對ZLSY20菌株生長的影響相對較小，對應的最佳組合為A3B3C1，即蛋白胨1.5%、酵母膏2.0%和蔗糖2.0%。方差分析結果（表2）顯示，3種營養物質對ZLSY20菌株生長的影響無顯著差異（P>0.05，下同）。

2. 3 ZLSY20菌株發酵條件優化結果

2. 3. 1 培養基初始pH 由圖7可知，最適ZLSY20菌株生長的pH在6～8，其中pH 6時生長較快，而pH 4和pH 5時基本不生長，因此選擇pH 6、7和8進行正交試驗。

2. 3. 2 培養溫度 由圖8可知，在24～32 ℃溫度范圍內ZLSY2菌株生長較好，20 ℃及以下不適合該細菌生長，因此選擇24、28 和32 ℃進行正交試驗。

2. 3. 3 培養時間 由圖9可知，ZLSY20菌液濃度隨著培養時間的延長逐漸增加，但培養48 h后趨于穩定，為提高細菌產量并在發酵培養時能接入活性好、功效強的菌株，選擇12、24和48 h進行正交試驗。

2. 3. 4 培養時間、溫度和初始pH正交試驗 培養時間、溫度和初始pH的正交試驗結果（表3）顯示，RC>RB>RA，即初始pH（C）對ZLSY20菌株產量的影響最大，其次為培養溫度（B）和培養時間（A），對應的最佳組合為A2B3C3，即最佳培養時間24 h、最佳培養溫度32 ℃、最適pH 8。方差分析結果（表4）顯示，3種發酵條件對ZLSY20菌株生長的影響無顯著差異。

2. 3. 5 初始接菌量、通氣量和轉速優化 由圖10～圖12可看出，接菌量選擇0.05%、0.10%和0.50% 3個水平，通氣量選擇20、40和80 mL 3個水平，轉速選擇160、180和200 r/min 3個水平進行正交試驗較適宜。

2. 3. 6 初始接菌量、通氣量和轉速正交試驗 初始接菌量、通氣量和轉速的正交試驗結果（表5）顯示，RB>RC>RA，即通氣量（B）對ZLSY20菌株生長的影響最大，其次是轉速（C）和接菌量（A），對應的最佳組合是A1B1C3，即接菌量0.05%、通氣量20 mL、轉速200 r/min。方差分析結果（表6）顯示，通氣量對ZLSY20菌株的生長速度影響顯著。

2. 4 ZLSY20菌株生長曲線測定結果

按最優方案配制發酵液，并在最適發酵條件下進行發酵培養，結果（圖13）顯示，菌株接種后0～2 h為生長延遲期，2～24 h其生長曲線接近直線，細菌生長速度最快，為生長對數期，在24～48 h內細菌緩慢增長，隨后進入生長穩定期，最高產菌量為48 h時，OD為2.14;84 h后ZLSY20菌株的OD開始緩慢下降。

3 討論

目前，大部分細菌采用LB培養基培養，因為在LB培養基上生長的細菌類群相對單一，存在單一類群優勢或抑制其他類群生長的現象（代先祝等，2010;吳海波等，2018）。本研究分別采用YSP、NA、NYBD、CM、EAS和LB培養基對除草活性成團泛菌ZLSY20菌株進行搖床培養，發現該菌在YSP培養基上生長最好，其次為LB培養基。為提高細菌產量并在發酵培養時能接入活性好、功效強的菌株，對ZLSY20菌株進行生長曲線測定，結果發現在發酵2～24 h為其對數生長期，因此后續可在該對數生長期的中后期時發酵和取樣。

影響微生物發酵的因子較多，主要包括碳源、氮源、溫度和初始pH等，但不同的微生物對碳源、氮源和溫度等條件的選擇存在差異（梁艷瓊等，2011;鄒立飛等，2018）。本研究結果表明，各碳源對ZLSY20菌株生長速度的影響差異不明顯，說明ZLSY20菌株的發酵培養基對碳源的選擇范圍較廣，其中對蔗糖的利用效果較好;對于氮源，發現蛋白胨和胰蛋白胨均有利于菌體生長，而銨態氮源硝酸銨等難以被利用，且銨態氮作氮源時在一定程度上抑制了ZLSY20菌株的生長。在發酵條件優化方面，通過正交試驗，對培養基初始pH、培養溫度、接種量、通氣量和轉速進行優化，發現ZLSY20菌株最適pH為8，說明該菌適合在中性或略偏堿性的環境中生長;ZLSY20菌株在16～40 ℃內均能正常生長，說明其對溫度環境的適應能力較強，在32 ℃下生長最好，但在24 ℃以下生長較慢，表明低溫不適合用于該菌的發酵培養。轉速和通氣量均與培養液中的氧氣溶解量有關，正交試驗結果表明，通氣量對ZLSY20菌株的生長效果影響顯著;通氣量20 mL、轉速200 r/min時的菌液濃度最大;接菌量為0.05%時ZLSY20菌株生長最好，細菌能充分利用養分和空間，接菌量過大則因養分和空間有限而抑制細菌生長。

張曉宇（2014）研究報道成團泛菌XM2發酵的最優培養基配方為酵母膏15 g、麥芽糖5 g、NaC1 5 g、蒸餾水1000 mL、初始pH 7.0;最優培養條件為溫度20 ℃、裝液量40 mL/250 mL、接種量10%、發酵時間24 h。柯紅嬌等（2014）制備成團泛菌Ljb-2發酵培養液的條件為溫度30 ℃、轉速200 r/min、接種量1%、培養時間48 h。上述研究結果表明，不同菌株的最佳發酵條件不同，可能與其遺傳特征和生理特性不同有關，也與所獲取菌株的特定生境有關。

本研究對ZLSY20菌株的發酵條件進行優化并確定了最佳條件，提高其發酵產量，有望從中分離得到有益的活性物質，為利用細菌防治紫莖澤蘭打下一定的實驗基礎。但對于發酵液的活性成分尚不清楚，后續將對菌株的除草活性成分進行深入探究。

4 結論

通過對除草活性成團泛菌ZLSY20菌株的發酵培養基成分和發酵條件進行優化，發現最適合ZLSY20菌株生長的培養基及組分為YSP培養基（蛋白胨1.5%、酵母膏2.0%、蔗糖2.0%），最適合ZLSY20菌株生長的發酵條件為培養時間24 h、培養溫度32 ℃、初始pH 8、接菌量0.05%、通氣量20 mL/250 mL、轉速200 r/min。優化方案下可有效提高ZLSY20菌株的發酵產量，建立的方案可用于快速、大批量地發酵ZLSY20菌懸液。

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（責任編輯 麻小燕）