固定化酵母發酵制備辣木果酒的工藝研究

黃春秋 林君 麻少瑩 黃衛萍 黃友琴 馬騰飛

摘要：【目的】研究固定化酵母發酵制備辣木果酒的工藝條件，為辣木資源開發提供新途徑?！痉椒ā恳愿呋钚愿山湍赴茬?71#為固定酵母載體，通過單因素試驗探討辣木液初始糖度、發酵溫度、焦亞硫酸鈉用量和發酵pH等因素對辣木果酒酒精度形成的影響，再通過正交試驗確定辣木果酒的最佳發酵工藝條件?！窘Y果】影響辣木果酒發酵工藝的因素排序為發酵溫度>初始糖度>發酵pH>焦亞硫酸鈉用量，發酵溫度對辣木果酒酒精度有顯著影響（P<0.05）。固定化酵母發酵制備辣木果酒的最佳工藝：初始糖度25%、發酵溫度29 ℃、焦亞硫酸鈉用量80 mg/L、發酵pH 4.5，在此條件下得到的果酒酒精度達11.6%（v/v）?！窘Y論】利用固定化酵母發酵制得的辣木果酒色澤淡黃、清澈穩定，具有淡雅的辣木清香，口感醇和，風味獨特，研究工藝參數經濟可行，可為規模化生產提供數據基礎。

關鍵詞： 辣木果酒;固定化酵母;發酵;工藝優化

中圖分類號： S792.99? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A? ? ? ?文章編號：2095-1191（2019）09-2065-06

Abstract：【Objective】The processing conditions of using immobilized yeastto ferment Moringa oleifera fruit wine was studied to provide new ways for M. oleifera resource development.? 【Method】The effects of initial sugar content， fermentation temperature， sodium pyrosulfite dosage and pH on the M. oleifera fermentation liquid were studied by single factor experiment with high active dry yeast Angel No.171 as the carrier of fixed yeast. The optimum fermentation conditions of M. oleifera fruit wine were determined by orthogonal experiment. 【Result】The factors affecting the fermentation process of M. oleifera fruit wine were as follows as fermentation temperature>initial sugar content>fermentation pH>sodium pyrosulfite dosage. Fermentation temperature had significant effects on M. oleifera fruit wine alcoholicity（P<0.05）. The results of the single factor experiment of immobilized yeast showed that the optimum initial sugar content， fermentation temperature， sodium pyrosulfite dosage and fermentation pH were 25%， 29 ℃， 80 mg/L and 4.5， respectively. Under such conditions， the obtained alcoholicity was 11.6%（v/v）. 【Conclusion】The obtained M. oleifera fruit wine produced by immobilized yeast fermentation has light yellow color， clear and stable color， elegant M. oleifera fragrance， mellow taste， unique flavor. The processing parameters are feasible， and also can provide data basis for large-scale production.

Key words：? Moringa oleifera; immobilized yeast; fermentation; processing optimization

0 引言

【研究意義】辣木（Moringa oleifera）又稱奶牛樹，為辣木科辣木屬多年生熱帶落葉喬木，傳統辣木生長在非洲東部及印度北部（王立等，2016）。辣木具有良好的功能活性，研究表明，辣木葉和辣木籽中含有豐富的蛋白質、維生素和礦物質等多種營養成分，已廣泛應用于食品生物、醫藥保健和凈水處理等領域（Jahn，1996）;辣木葉粉比優良保健食品螺旋藻含有更高的蛋白質和總膳食纖維，且脂肪含量偏低，更符合現代人們的營養健康需求（劉昌芬和李國華，2004）;辣木葉中的植物黃酮、蛋白質和脂肪酸具有抗氧化活性和調節血糖功能，可作為重要的藥用資源（趙歡等，2017）。2012年11月我國原衛生部批準辣木葉作為新資源食品，盡管國外有著悠久的食用歷史（Anwar et al.，2007），但國內尚未被大眾所熟識。目前市場上辣木產品較少，僅有辣木粉、辣木茶飲料等少數品種，未見辣木發酵酒、辣木醋等產品銷售。因此，開展辣木發酵酒尤其是辣木果酒的研究，對于豐富辣木多元化產品和促進辣木產業深加工發展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，關于辣木葉貯藏及相關食品加工方面的研究已有一些報道。馬春花等（2018）進行辣木鮮葉貯藏保鮮試驗，結果表明，辣木鮮葉在貯藏期間蛋白質含量變化不明顯，但維生素含量損失較大，貯藏保鮮的最佳溫度為4 ℃，貯藏時間不超過7 d;陳玉芹等（2017）以辣木葉為原料制作辣木茶，測得辣木茶含有17種氨基酸，總量為434.90 mg/g，其中含有7種必需氨基酸，含量明顯高于傳統綠茶，可作為一種新型茶品進行開發;盧仰文等（2018）以脫脂乳粉為原料，輔以辣木粉和干酪粉制備酸凝辣木干酪，其最佳工藝參數為脫脂乳粉50 ℃復水，63 ℃下30 min殺菌，降溫至26 ℃，加入檸檬汁稀釋液B至pH 4.6，靜置20 min，過濾排除乳清，加入0.2%辣木粉和1.0%干酪粉搓揉混勻后得到成品;王小敏等（2018）以辣木葉為原料，加入甘草、山楂和決明子，研發出一種復合固體飲料，具有通便功效。國內有關辣木果酒的研究報道較少，僅見于少量公開的發明專利。王憲波（2015）先把辣木葉洗凈、陰干、粗碎，制成250～300目的超細粉，將辣木粉與酵母按50∶1～200∶1的比例摻勻，經固體糖化發酵得到辣木基料;焦家良等（2017）用辣木粉、葛根、牛蒡根和玉竹等原料中一種或幾種混合，干燥、粉碎，過篩制得辣木粉，再經水溫30 ℃浸泡，固液分離，然后加入酵母發酵制得辣木果酒;楊濤（2017）、祝澤英等（2017）將辣木梗、辣木根和高粱混合，經酒曲發酵，過濾即得新型白酒保健辣木果酒?！颈狙芯壳腥朦c】發布的辣木酒專利中，多采用浸泡法制辣木露酒，或與酒曲發酵制白酒型辣木果酒，尚未見利用固定化酵母發酵辣木制酒的相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】提取辣木葉基料有效成分，通過單因素試驗和正交試驗，探討辣木液初始糖度、發酵溫度、焦亞硫酸鈉用量和pH等因素對辣木果酒殘糖量和酒精度的影響，以期獲得最佳發酵工藝，為辣木資源的開發提供新途徑。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

新鮮辣木葉為印度改良種PKM1辣木，采自廣西農業職業技術學院中草藥園。主要試劑：白砂糖（純度95%，南寧糖業股份有限公司）;高活性干酵母安琪171#（湖北安琪酵母股份有限公司）;海藻酸鈉（食品級，25 kg/包，安徽中旭生物科技有限公司）;無水氯化鈣（食品級，四川華源盛泰生物科技有限公司）;焦亞硫酸鈉（食品級，25 kg/包，壽光市鼎昊經貿有限公司）;檸檬酸（食品級，山東檸檬生化有限公司）。主要儀器設備：C21-SK2105電磁爐（廣東佛山美的空調設備有限公司）;30B-X型中草藥專用粉碎機（常州市力度干燥設備有限公司）;pHSJ-3F型pH計（上海精密科學儀器有限公司）;WTY型手持旋光儀（泉州中友光學儀器有限公司）;DHG-9245A恒溫箱干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）;HH-S數顯恒溫水浴鍋（江蘇省常州市金壇華特實驗儀器有限公司）;AR153CN型分析天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司];實驗室型立式殺菌鍋DN400型（上?？苿跈C械設備有限公司）;酒精計（河北省武強縣儀都玻璃儀器儀表廠）;NAI-ZLY-6L智能一體化蒸餾儀（上海那艾精密儀器有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 工藝流程 辣木葉（新鮮、無病蟲）→清洗→烘干→粉碎→浸提→過濾取汁→殺菌（90 ℃，15 min）→冷卻→糖酸調配→硫處理→加固定化酵母→發酵→調配→澄清過濾→殺菌→灌裝→辣木果酒成品。

1. 2. 2 操作步驟

1. 2. 2. 1 辣木基液提取 新鮮辣木葉烘干（60 ℃，12 h）、粉碎，用水（料液比1∶6）于85～90 ℃下浸提25 min，60目過濾即得辣木基液。

1. 2. 2. 2 固定化酵母制備 取0.3%高活性干酵母安琪171#，加入3%蔗糖溶液中，于30 ℃下活化30～60 min，再與0.1%海藻酸鈉溶液混合，加入4%氯化鈣溶液于3～6 ℃低溫下形成凝膠，然后用無菌水沖洗3次，置于3～6 ℃冰箱固化24 h即得固定化酵母。

1. 2. 2. 3 辣木發酵液制備 取辣木基液于90 ℃殺菌15 min，冷卻調整糖度，按試驗設計加入焦亞硫酸鈉進行硫化抑菌處理。

1. 2. 2. 4 辣木果酒調配和殺菌 將發酵好的辣木基酒進行糖酸等風味調配，澄清過濾后于90～93 ℃高溫殺菌，灌裝密封。

1. 2. 3 單因素試驗設計 各試樣中加入100 mg/L焦亞硫酸鈉和固定化酵母后進行酒精發酵，研究不同初始糖度、發酵溫度、焦亞硫酸鈉用量和發酵pH對辣木發酵液殘糖量和酒精度的影響。設定初始糖度為20%、25%、30%、35%和40%;發酵溫度為20、23、26、29和32 ℃;焦亞硫酸鈉用量為60、80、100、120和140 mg/L（陳智理等，2010）;pH為3.0、3.5、4.0、4.5和5.0。

1. 2. 4 正交試驗設計 依據單因素試驗結果，以初始糖度、發酵溫度、焦亞硫酸鈉用量和發酵pH為考察因素進行4因素3水平正交試驗，優化固定化酵母發酵制備辣木果酒的工藝條件，試驗設計見表1。

1. 2. 5 測定方法 利用手持旋光儀測定殘糖量，pH計測定pH;按照GB/T 15038—2006酒精計法測定酒精含量，按照GB/T 15038—2006電位滴定法測定總酸。

1. 3 統計分析

單因素試驗數據采用Excel 2007進行處理，正交試驗設計采用方差分析進行統計分析。

2 結果與分析

2. 1 單因素試驗結果

2. 1. 1 初始糖度對固定化酵母發酵的影響 根據前期研究的酵母菌用量單因素試驗結果，確定固定化酵母用量為0.3%，發酵溫度為26 ℃，研究不同初始糖度對固定化酵母發酵辣木果酒的影響，結果如圖1和圖2所示。從圖1可看出，隨著發酵時間的延長，辣木果酒的殘糖量明顯下降;殘糖量與初始糖度密切相關，初始糖度越大，殘糖量也越高，是由于一定量酵母可利用的糖有限。因此，過高的初始糖度不利于辣木果酒徹底發酵，甚至會導致辣木果酒成品過甜而影響感官品質。由圖2可知，在一定糖度范圍內，隨初始糖度的增加，辣木果酒酒精度也逐漸增加，但初始糖度過高會影響酵母細胞的生長和代謝，不利于辣木果酒徹底而持續穩定地發酵。當初始糖度為30%時，酒精度達最高值9.8%（v/v）;初始糖度超過30%后，酒精度呈下降趨勢，其原因可能是高濃度糖的滲透壓抑制了固定化酵母的活性和增殖（高兆建，2005）。因此，初始糖度以選擇25%～30%為宜。

2. 1. 2 發酵溫度對固定化酵母發酵的影響 酵母對環境溫度較敏感，發酵溫度直接影響固定化酵母的活性和釀造效果。固定化酵母在一定條件下發酵，不同發酵溫度對辣木果酒發酵效果的影響見圖3和圖4。由圖3可知，隨著發酵溫度升高，辣木果酒發酵速度越快、殘糖量降低明顯。由圖4可知，不同發酵溫度下辣木果酒的酒精度存在明顯差異。酒精度隨發酵溫度的升高逐漸上升，發酵溫度為26 ℃時酒精度達最高值9.8%（v/v），之后隨發酵溫度升高酒精度呈下降趨勢，32 ℃時酒精度僅為7.2%（v/v），可能是溫度升高時，固定化酵母的活性反而受到抑制。因此，發酵溫度選擇26 ℃左右較合適。

2. 1. 3 焦亞硫酸鈉用量對固定化酵母發酵的影響

焦亞硫酸鈉具有抑菌、抗氧化和澄清作用，常用于果酒發酵。但其用量須嚴格控制，用量過多時，既不符合食品衛生和安全要求，又影響果酒的發酵效率和風味品質。由圖5和圖6可知，隨著焦亞硫酸鈉用量增多，辣木果酒的殘糖量逐漸下降，酒精度上升，當焦亞硫酸鈉用量為100 mg/L時，辣木果酒酒精度達9.4%（v/v），之后用量越大酒精度反而降低。說明焦亞硫酸鈉用量過大不利于酵母發酵，可能因為焦亞硫酸鈉濃度過高反而抑制酵母活性，影響發酵效率。因此，辣木果酒發酵制備選擇焦亞硫酸鈉添加量以80～120 mg/L為宜。

2. 1. 4 發酵pH對固定化酵母發酵的影響 酸度（pH環境）不僅影響各種微生物的生長繁殖，還會影響酶活力。從圖7可看出，隨著pH增大，辣木果酒的殘糖量逐漸降低，pH達5.0時，經6 d發酵殘糖量可降至5.4%。從圖8可看出，隨著pH增大，辣木果酒酒精度逐漸升高，當pH為4.0時酒精度達最高值9.7%（v/v），之后pH增大酒精度反而降低。說明pH過低或過高均不利于酵母發酵，原因可能是pH過低或過高，環境的酸堿度均會抑制酵母活性，影響發酵效率。故辣木果酒發酵環境選擇在pH 3.5～4.5為宜。

2. 2 正交試驗結果

由表2可知，影響固定化酵母發酵辣木果酒的因素排序為B>A>D>C，即發酵溫度影響最大，初始糖度和發酵pH次之，焦亞硫酸鈉用量影響最小。最佳組合為A2B3C1D3，即固定化酵母發酵辣木果酒最佳工藝條件為初始糖度25%、發酵溫度29 ℃、焦亞硫酸鈉用量80 mg/L、發酵pH 4.5。

由表3可知，發酵溫度對固定化酵母發酵辣木果酒的影響效果顯著（P<0.05），初始糖度、焦亞硫酸鈉用量和發酵pH的影響均未達顯著水平（P>0.05）。

為驗證正交試驗結果，在最佳發酵條件下進行3次平行試驗，辣木果酒酒精度分別為11.7%（v/v）、11.4%（v/v）和11.8%（v/v），平均值11.6%（v/v），高于正交試驗中任一組合的結果，驗證了正交試驗結果的正確性和可重復性。

3 討論

固定化酵母相對于游離酵母具有發酵力強、發酵穩定、能連續發酵的優點，已廣泛應用于多種果酒的發酵生產。本研究所選用的酵母為前期試驗篩選出的高活性干酵母安琪171#，該酵母作為固定化酵母發酵生產辣木果酒的研究鮮見報道。前期研究進行游離酵母與固定化酵母發酵的試驗對比，結果表明除發酵初期因固定化酵母細胞被包埋而發酵較慢外，后期發酵速度、持續發酵穩定性和產酒率（即酒精度）均優于游離酵母，與武運等（2008）采用固定化酵母發酵蟠桃酒、余森艷等（2015）采用固定化酵母釀造臍橙果酒的研究結果一致。故本研究選用固定化酵母發酵制備辣木果酒，可較好地保證生產辣木發酵酒的經濟效率、得酒率和果酒品質。

本研究采用單因素試驗和正交試驗考察初始糖度、發酵溫度、焦亞硫酸鈉用量和發酵pH對固定化酵母發酵生產辣木果酒酒精度的影響，結果表明，初始糖度25%、發酵溫度29 ℃、焦亞硫酸鈉用量80 mg/L和發酵pH 4.5為最佳發酵工藝條件，主要影響因素為發酵溫度，制得的辣木果酒酒精度高達11.6%（v/v）。研究結果和各影響因子的變化趨勢與陳智理等（2010）采用固定化酵母發酵制備香蕉菠蘿復合果酒、潘嫣麗等（2011）采用固定化酵母發酵制備雪蓮果—西番蓮復合果酒的結果基本相同，如初始糖度基本在20%～25%，pH 4.0～5.0為宜，也是經6 d左右時間發酵結束，說明固定化酵母的整體發酵基本規律一致。本研究所用抑制雜菌試劑為焦亞硫酸鈉，區別于亞硫酸氫鈉，其還原性更強、不易氧化損失，而亞硫酸氫鈉具有不愉快味，且易于氧化為硫酸鹽而降低抑菌作用;最適發酵溫度為29 ℃，略高于陳智理等（2010）、潘嫣麗等（2011）研究的20～25 ℃，可能是辣木基液不同于其他原料，若要提高固定化酵母的發酵活力，因此需稍高于其他果酒類的發酵溫度。

與焦家良等（2017）發酵制得辣木果酒，楊濤（2017）、祝澤英等（2017）經酒曲發酵得到的白酒保健辣木果酒相比，本研究制得的酒體色澤淡黃、清澈穩定，具有淡雅的辣木清香，口感醇和，風味獨特;同時工藝參數經濟可行，可為規?；a提供數據基礎。本研究制備得到的辣木果酒的呈香呈味、功效成分及功能驗證有待進一步研究。

4 結論

利用固定化酵母在最佳工藝條件下發酵制得的辣木果酒色澤淡黃、清澈穩定，具有淡雅的辣木清香，口感醇和，風味獨特，研究工藝參數經濟可行，可為規?；a提供參考。

參考文獻：

陳玉芹，尹紅星，王應清，王彥兵，李守嶺，胡永亮. 2017. 辣木茶的氨基酸分析及營養價值評定[J]. 南方農業學報，48（7）：1280-1285. [Chen Y Q，Yin H X，Wang Y Q，Wang Y B，Li S L，Hu Y L. 2017. Amino acid components and nutritional value in Moringa oleifera Lam. tea[J]. Journal of Southern Agriculture，48（7）：1280-1285.]

陳智理，楊昌鵬，郭靜婕. 2010. 固定化酵母發酵生產香蕉菠蘿復合果酒的工藝研究[J]. 安徽農業科學，38（36）：20732-20734. [Chen Z L，Yang C P，Guo J J. 2010. Stu-dies on process for producing banana pineapple compound fruit wine by immobilized yeast fermentation[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，38（36）：20732-20734.]

高兆建. 2005. 低醇菠蘿果酒釀造工藝的研究[J]. 中國釀造，（11）：16-19. [Gao Z J. 2005. Study on brewing technology of low-alcohol pineapple wine[J]. China Brewing，（11）：16-19.]

焦家良，李行，高瑾，邱智. 2017. 一種辣木保健酒配方及制備方法：中國，CN104673589B[P]. 2017-06-20. [Jiao J L，Li H，Gao J，Qiu Z. 2017. Formulation and preparation of a Moringa oleifera health wine：China，CN104673589B[P]. 2017-06-20.]

劉昌芬，李國華. 2004. 辣木的營養價值[J]. 熱帶農業科技，27（1）：4-7. [Liu C F，Li G H. 2004. Nutritional value of drumstick tree leaves[J]. Tropical Agricultural Science & Technology，27（1）：4-7.]

盧仰文，李慧芳，徐真，苗穎，馬儷珍，張愛琳. 2018. 酸凝辣木干酪加工工藝研究[J]. 現代農業科技，（16）：241-242. [Lu Y W，Li H F，Xu Z，Miao Y，Ma L Z，Zhang A L. 2018. Research on processing technique of acid coagula-ted Moringa cheese[J]. Modern Agricultural Science and Technology，（16）：241-242.]

馬春花，徐榮，王川，唐成順，張海明，郭剛軍，趙春攀，田洋，盛軍. 2018. 辣木鮮葉貯藏保鮮條件及品質變化的研究[J]. 云南農業大學學報（自然科學），33（6）：1139-1145. [Ma C H，Xu R，Wang C，Tang C S，Zhang H M，Guo G J，Zhao C P，Tian Y，Sheng J. 2018. Changes of the quality charactistics of Moringa oleifera leaves during storage and preservation[J]. Journal of Yunnan Agricultural University（Natural Science），33（6）：1139-1145.]

潘嫣麗，覃海元，黃友琴，歐學通. 2011. 固定化酵母發酵雪蓮果—西番蓮復合果酒工藝的研究[J]. 中國釀造，（2）：178-181. [Pan Y L，Qin H Y，Huang Y Q，Ou X T. 2011. Fermentation technology of yacon-passion fruit wine by immobilized yeast[J]. China Brewing，（2）：178-181.]

王立，黃宏建，譚沛濤，林健桃， 陳小玲，張磊. 2016. 辣木產業發展前景及種植技術探析[J]. 南方農業，10（27）：73-75. [Wang L，Huang H J，Tan P T，Lin J T，Chen X L，Zhang L. 2016. Development prospect and planting technology of Moringa oleifera industry[J]. South China Agriculture，10（27）：73-75.]

王憲波. 2015. 一種辣木果酒的制作方法：中國，CN103923806A[P]. 2015-12-09. [Wang X B. 2015. A method of making Moringa oleifera wine：China，CN103923806A[P]. 2015-12-09.]

王小敏，岳舒芮，張朔生. 2018. 山楂決明子甘草辣木葉復合固體飲料的研制[J]. 食品研究與開發，39（9）：61-65. [Wang X M，Yue S R，Zhang S S. 2018. Study on Crataegi fructus，Cassiae semen，Glycyrrhizae radix et rhizoma，Moringa oleifera leaves compound solid beverage processing technology[J]. Food Research and Development，39（9）：61-65.]

武運，楊海燕，郭才亮，艾克拜爾. 2008. 固定化酵母發酵蟠桃酒的工藝研究[J]. 釀酒，35（1）：102-105. [Wu Y，Yang H Y，Guo C L，Aikebaier. 2008. Study on peach wine by immobilized yeast fermentation[J]. Liquor Making，35（1）：102-105.]

楊濤. 2017. 一種保健辣木果酒及其生產工藝：中國，CN107057924A[P]. 2017-08-18. [Yang T. 2017. A healthy Moringa oleifera wine and its production technology：China，CN107057924A[P]. 2017-08-18.]

余森艷，李志紅，程海韻. 2015. 固定化酵母釀造臍橙果酒的工藝研究[J]. 湖北工程學院學報，35（6）：16-20. [Yu S Y，Li Z H，Cheng H Y. 2015. Study on brewing technology of navel orange fruit wine by immobilized yeast[J]. Journal of Hubei Engineering University，35（6）：16-20.]

趙歡，曹玉霖，朱彥鋒. 2017. 辣木的血糖調節功能研究進展[J]. 天然產物研究與開發，29（10）：1791-1796. [Zhao H，Cao Y L，Zhu Y F. 2017. Review on blood glucose regulating function of Moringa oleifera Lam.[J]. Natural Product Research and Development，29（10）：1791-1796.]

祝澤英，黃淑英，楊人瑋，祝潔，祝正林. 2017. 一種辣木果酒及其釀造方法：中國，CN106754060A[P]. 2017-05-31.? ? [Zhu Z Y，Huang S Y，Yang R W，Zhu J，Zhu Z L. 2017. A Moringa oleifera wine and its brewing method：China，CN106754060A[P]. 2017-05-31.]

Anwar F，Hussain A I，Iqbal S，Bhanger M I. 2007. Enhancement of the oxidative stability of some vegetable oils by blending with Moringa oleifera oil[J]. Food Chemistry，103（4）：1181-1191.

Jahn S A A. 1996. On the introduction of a tropical multipurpose tree to China：Traditional and potential utilization of Moringa oleifera Lamarck[J]. Senckenbergiana Biologica，75（1-2）：243-254.

（責任編輯 羅 麗）